ÖZET

Bu çalışmada monositlerden makrofaja farklılaşmada Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA)’nın uygulama zamanı ve dozuna yönelik uygun bir model oluşturulması amaçlanmıştır. Bu amaçla insan lösemi monosit hücre hattı (THP-1) farklı doz ve uygulama sürelerinde PMA ile uyarılarak hücrelerin makrofaja farklılaşmaları morfolojik olarak gösterilmiş ve hücre canlılığı üzerine etkileri değerlendirilmiştir.

THP-1 monosit hücreleri 6 kuyucuklu plaklarda 2x105/mL hücre olacak şekilde süspanse olarak üretilmiştir. Daha sonra üzerlerine %10 FCS içeren RPMI 1640 ile 10, 20, 40 ve 60 ng/mL konsantrasyonlarda sulandırılan PMA ilave edilerek, 24, 48 ve 72 saat inkübe edilmiştir. Süspanse THP-1 monosit hücrelerin yapışan makrofaj benzeri hücrelere farklılaşması, doku kültürü mikroskobunda hücre kültürü plaklarına tutunma ve fenotipik değişikliklerin gözlenmesi ile doğrulanmıştır. Canlı hücreler tripan mavisi boyama yöntemi ile belirlenmiştir.

THP-1 hücreleri için fenotipik değişiklikleri ve hücre canlılığı açısından elde edilen en iyi sonuçlar 20 ng/mL PMA konsantrasyonu ve 48 saat inkübasyon süresi olarak saptanmış, bu konsantrasyon ve inkübasyon süresinde hücre canlılığı %92,2 olduğu bulunmuştur. 40 ng/mL PMA uygulaması 48. saatte 10 ve 20 ng/mL PMA uygulamasına göre hücre sayısında belirgin azalmaya neden olurken 72. saat uygulaması sonrası gruplar arasında fark görülmemiştir. Bu sonuçlar in vitro makrofaj modellerinin gerçek fizyolojik şartları tam olarak yansıtması için THP-1 monositlerinin makrofaja farklılaşmasının optimize edilmesi gerekliliğini göstermektedir. Bu çalışmada en iyi hücre farklılaşmasının THP-1 hücrelerine 20 ng/mL PMA eklenmesi ve bu hücrelerin 48 saat inkübasyona bırakılması ile ortaya çıktığı sonucuna varılmıştır.

Giriş

Konağa mikroorganizma girdiğinde, enfeksiyondan önce var olan ve enfeksiyonun ilk dakikaları içinde etkinleşen doğal savunma mekanizmaları ile karşılaşır (1). Doğal immün/enflamatuvar cevabı başlatan ve vücuda giren patojen ile ilk temasta bulunan hücre makrofajdır (2-4).

Makrofajların; yüzeylerindeki çok sayıdaki reseptörleri aracılığıyla patojenleri tanıması, patojenleri ortadan kaldırmak için hücre farklılaşmasını ve çoğalmasını düzenlemesi, enfeksiyon bölgesine etkili hücreleri ve enfeksiyon kontrol altındayken anti-enflamatuvar sitokinleri ortama çekmek için çeşitli çözünebilir pro-enflamatuvar kemokinlerin ve sitokinlerin üretilmesi ve salınması, patojenlerin yutulması yada içine alınması ve sindirilmesi yani fagositoz başlıca fonksiyonları arasındadır (2, 5).

Makrofajların in vitro olarak fonksiyonlarını, mekanizmaları, sinyal yollarını araştırmak için primer periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ve farklı derecelerde farklılaşma gösteren monosit hücre kültürleri kullanılmaktadır (6-8). PBMC’lerin in vitro gelişmesi ve çoğalması zor olduğu için, özellikle in vitro çalışmalarda süresiz çoğalabilme özelliğine sahip transformasyona uğramış primer hücreler olan ve daha stabil fenotipleri bulunan THP-1, U937, ML-2, HL-60 ve Mono Mac 6 gibi monosit hücre hatları yaygın olarak kullanılmaktadır (7, 8).

İlk defa akut monositik lösemili bir yaşındaki erkeğin periferik kanından elde edilmiş olan THP-1, monosit/makrofaj farklılaşmasını ve fonksiyonunu incelemek için kullanılan en yaygın hücre hattıdır (6, 7). Süspanse olarak üreyen THP-1 hücreleri forbol-12-miristat-13-asetat (PMA), 1α, 25-dihidroksivitamin D3 (vD3) ve makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile uyarıldıklarında makrofaj benzeri hücrelere farklılaşır (9, 10-12). İn vitro olarak THP-1 monosit hücrelerinden makrofaj hücrelerinin elde edilmesinde kullanılan uyaranların doz ve canlılık optimizasyonunun yapıldığı standart bir protokol bulunmamaktadır. PMA, makrofaj elde etmek için en etkili farklılaşma ajanıdır. Çeşitli çalışmalarda kullanılan PMA konsantrasyonunda, hücrelerin PMA’ya maruz kalma süresinde ve başlangıçtaki hücre miktarında farklılıklar olduğu görülmektedir (7, 9, 13-17).

Bu çalışmada, in vitro sistemlerde araştırma modeli olarak kullanılmak üzere monositik hücre hattından makrofaj hücrelerinin elde edilmesinde PMA’nın uygulama zamanı ve dozuna yönelik uygun bir modelin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

ücre Kültürü; Bu çalışmada THP-1 (DSMZ, ACC-16) Avrupa Kültür Kolleksiyonu Organizasyonu, Almanya Kültür Koleksiyonu’ndan temin edilmiştir. Monosit hücreleri %10 FCS içeren RPMI 1640 ile sulandırılarak 800 rpm’de, 4 ºC’de 10 dakika santrifüj edildikten sonra 1x10⁵ hücre/mL olacak şekilde 25 cm² yüzeyli hücre kültürü şişelerinde üretildi (6, 10, 12).

Hücresel Farklılaşma; THP-1 monosit hücreleri aderan olmayan hücre olduğundan 6 kuyucuklu plaklarda 2x10⁵/mL hücre olacak şekilde süspanse olarak üretildi. Daha sonra üzerlerine %10 FCS içeren RPMI 1640 ile içerisinde 10, 20, 40 ve 60 ng/mL konsantrasyonlarda sulandırılan PMA ilave edilerek 24-72 saat süre ile inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon süreleri sonunda hücreler besiyeri ile yıkanıp, PMA’dan uzaklaştırıldı. Daha sonra hücrelerin üzerine taze besiyerleri eklendi. Süspanse THP-1 monosit hücrelerin yapışan makrofaj benzeri hücrelere farklılaşması, doku kültürü mikroskobunda hücre kültürü plaklarına tutunma ve fenotipik değişikliklerin gözlenmesi ile doğrulandı. Canlı hücreler tripan mavisi boyama yöntemi ile belirlendi (6, 10, 12). Bu amaçla hücreler Thoma lamında Hanks’in dengeli tuz çözeltisi içinde hazırlanan %0,4 (w/v) tripan mavisi boyası kullanılarak sayılmıştır. Mikroskobik incelemede tripan boyası ile cansız hücreler maviye boyanırken, canlı hücrelerde herhangi bir boyanma saptanmamıştır. Canlı hücrelerin oranı şu şekilde hesaplandı: Boyanmamış hücrelerin sayısı/toplam hücre sayısı x100 (18).

Bulgular

PMA ile muamele edilmemiş THP-1 hücreleri kültür plaklarının yüzeylerine yapışmadan yuvarlak ve süspanse şekilde üremiştir (Şekil 1).

Hücresel Farklılaşma

Süspanse olarak üreyen THP-1 monosit hücreleri, 10-60 ng/mL PMA konsantrasyonlarında ve 24-72 saatlik inkübasyon sürelerinin sonunda yapışan makrofaj benzeri hücrelere diferansiye olmuş ve hücre kültür plaklarının yüzeylerine yapışmıştır (Şekil 2-3-4). Kültür plaklarına yapışan hücrelerin yüzeyinde bulunan birçok çıkıntı kaybolmuş ve hücreler yassılaşarak ameboid bir özellik göstermişlerdir. THP-1 hücreleri için fenotipik değişiklikler ve hücre canlılığı açısından elde edilen en iyi sonuçlar 20 ng/mL PMA konsantrasyonu ve 48 saat inkübasyon süresi olarak saptanmış (Şekil 5), bu konsantrasyon ve inkübasyon süresinde hücre canlılığı (%92,2) (Şekil 6) olarak bulunmuştur.

Tartışma

Monosit/makrofajların in vivo fonksiyonlarını araştırmak için hücre tabanlı in vitro deneyler kullanılmaktadır. Bunun için yapılacak ilk adım, primer hücreleri kullanmanın mümkün olmadığı durumlarda biyolojik olarak monosit/makrofajları temsil eden bir hücre hattının seçimidir. Uygun çalışma koşulları gerçek, güvenilir ve tekrarlanılabilen sonuçların oluşması için önemlidir. İnsan leukemia monosit hücre hattı, THP-1, in vitro ortamda primer makrofajların bir temsilcisi olarak en çok kullanılan hücredir (7, 16, 19).

1980’deki orijinal tanımından beri, THP-1 hücreleri, makrofajların aktivasyonunu ve farklılaşmasını, enflamasyondaki yanıtlarını, enflamatuvar hastalıkların mekanizmalarını anlamak için yapılan çok sayıda çalışmada monosit-makrofaj farklılaşması bir model olarak kullanılmıştır (6, 8, 10, 11, 20, 21).

THP-1 gibi hücre kültürlerinin kullanımı, primer kültürlere kıyasla çok sayıda avantaja sahiptir. Bunlar arasında homojen genetik zemin oluşturması, hücre fenotipindeki değişkenliği en aza indirgemesi, gen transfeksiyonu ile genetik modifikasyona izin vermesi sayılabilir. Bununla birlikte, hücre kültürü modelinde olumsuz kültür koşulları, optimum fonksiyon ve sayıda hücre kullanılmaması araştırmanın sonucunu etkilemektedir (16).

Monositlerin makrofajlara farklılaşması, hücrelerin morfolojik değişimlerine göre belirlenir. Çalışmamızda, THP-1 monosit hücre kültürünün PMA ile uyarılmasında, kullanılan tüm konsantrasyonlarda hücreler diferansiye olmuş ve kültür plaklarının yüzeylerine yapışmışlardır. Hücreler fenotipik değişiklikler ve hücre canlılığı açısından değerlendirildiğinde, en optimal PMA konsantrasyonunun 20 ng/mL ve inkübasyon süresinin 48 saat olduğu saptanmıştır (Şekil 5). 20 ng/mL PMA konsantrasyonunda ve 48 saatlik inkübasyon süresinde hücre canlılığı en yüksek oran olan %92,2’ye ulaşmıştır (Şekil 6). PMA’nın 40 ng/mL konsantrasyonda uygulaması 10 ve 20 ng/mL PMA uygulamasına göre 48. saatte hücre sayısında belirgin azalmaya neden olmuştur. PMA’nın tüm konsantrasyonlarında hücre farklılaşması ve canlılığı açısından 72. saatten sonra gruplar arasında anlamlı fark görülmemiştir.

Bu optimize ettiğimiz sonuçlara göre uyardığımız makrofajlarla yaptığımız bir çalışmada, epitel hücresi ile temasının olduğu kokültürlerde etkileşimleri araştırılmıştır. Bakterisidal etkinin, epitel ve makrofaj hücrelerinin birlikte olduğu kültürlerde hücrelerin tek başına olduğu kültürlere göre arttığı ve in vitro enflamatuvar yanıtın hücre-hücre teması ile yükseldiği sonucuna varılmıştır (22).

Yaptığımız başka bir çalışmada bulunan optimum PMA ile farklılaştırılan hücrelerde bazal midkin, tümör nekroz faktör-alfa (TNF-a) ve IL-10 salınımının kontrollere göre daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Diğer PMA konsantrasyonları ile karşılaştırıldığında, TNF-a ve IL-10 salınımının en yüksek seviyesi 20 ng/mL’de 48. saatte gözlenmiş ve bu dozdan sonraki cevaplarda istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmemiştir (23).

Çalışmamızda farklı doz ve zamanlarda PMA uyarımı sonrası farklılaşma sürecinde başlangıç monosit hücre sayısı eşit olmasına rağmen makrofaj hücre sayısının da belirlenmesinin önemli olabileceği düşünülmüştür. Başlangıçta PMA ile uyarılan THP-1 monositleri makrofajlara farklılaştıktan sonra, in vitro çalışmalarda kullanılmadan önce PMA’yı uzaklaştırmak ve hücresel iyileşmeyi sağlamak için PMA’nın olmadığı bir kültür ortamında bırakılması gerektiği düşünülmektedir.

Sonuç

Bu çalışma sonucunda THP-1 makrofaj fonksiyonunun araştırılmasında tek bir PMA farklılaşma protokolünü önermektedir. Böyle bir standardın benimsenmesi, in vitro deneysel verilerin in vivo olarak uygunluğunu arttıracak ve THP-1 hücrelerinin kullanıldığı in vitro çalışmalar arasındaki tutarlılığı sağlayacaktır.

Etik

Etik Kurul Onayı: Hücre kültürü kullanıldığından etik kurul onayı alınmamıştır.

Hasta Onayı: Hasta onayı alınmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Finansal Destek: Yazar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.