ÖZET

Çalışmada astım tanısı olan ve olmayanlardan elde edilen balgamların, eozinofil yüzdesi, Charcot-Leyden Kristalleri (CLK) varlığı ve balgam örneklerinin kültür sonuçları açısından değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

Çalışmada Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Cebeci Merkez Mikrobiyoloji Laboratuvarı’na Şubat 2021-Haziran 2021 tarihleri arasında gelen 74 adet balgam kültür örneği değerlendirildi. Gönderilen örneklerin mikroskobik değerlendirmeleri Gram ve Giemsa boyalı preperatlar ile yapıldı. Gram boyama sonucuna göre “uygun örnek” olarak kabul edilen balgam örneklerinin kültür sonuçları değerlendirildi. Üreyen mikroorganizmalar konvansiyonel yöntemler ve otomatize sistemler ile tanımlandı. Otomatize sistemler olarak VITEK II (BioMérieux, Fransa) ve MALDI-TOF MS (BioMérieux, Fransa) kullanıldı. Antimikrobiyal duyarlılık testleri European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing önerileri doğrultusunda uygulandı ve değerlendirildi.

Toplam 74 balgam örneği değerlendirildi. Astımlı hastaların %40,9’unda balgamda eozinofili saptandı. Astım tanısı almamış (n=52) hastaların ortalama eozinofil yüzdesi %0,63 olarak bulunurken, astım hastalarında (n=22) bu oran %3,04 olarak saptandı. Astım tanısı alanların balgam örneklerinin dördünde CLK tespit edildi. Astımı olan hastaların balgam örneklerinin 6’sında (%27,2) astımı olmayan hastaların 16’sında (%30,7) üreyen mikroorganizmalar etken olarak değerlendirildi. Örneklerden en sık izole edilen etken Pseudomonas aeruginosa’dır. Tüm ilaçlara dirençli mikroorganizma izole edilmedi.

Astım gibi havayolu hiperreaktivitesi olan olgularda klinik tanıya yardımcı olacak laboratuvar parametreleri olarak hem eozinofil yüzdesi hem de CLK varlığının birlikte değerlendirilmesinin uygun olacağı düşünülmüştür.

Giriş

Astım genel tanım olarak epizodik geri dönüşümlü havayolu daralması ile seyreden kronik havayolu enflamasyonu olarak tanımlanmaktadır. Astım patogenezinde birçok hücre ve hücresel element önemli rol oynamaktadır. Eozinofillerin, mast hücrelerinin ve T lenfositlerin infiltrasyonu ile birlikte havayolu duvarında aşırı duyarlılığa neden olan yapısal değişiklikler vardır (1). Eozinofilik enflamasyon hem akut astımda hem de çocukluk çağı astımında sıktır. Astımın en sık görülen fenotipi olan eozinofilik astım tipi havayollarında eozinofil artışının gösterilmesi ile konulmaktadır. Eozinofilik astımın tanısında, klinik ile değerlendirilmesinde biyobelirteç olarak eozinofiller kullanılmaktadır (2-4). Balgam örneğinde %3 üzerinde eozinofil görülmesi ile eozinofilik astım fenotipi tanısı konulmasında yardımcı olmaktadır.

Astımlı hastalarda epitelyal bütünlüğün bozulması ile bronş mukozasında bulunan eozinofiller bronş lümenine geçer. Bu eozinofiller eozinofil katyonik protein salgılayan aktive eozinofillerdir ve bunlardan açığa çıkan lipofosfolipaz enzimi in vitro ve in vivo ortamda kristalleşir. Bu kristallere Charcot-Leyden Kristalleri (CLK) adı verilir, uzunluğu 50 μm olan eşkenar dörtgen lizofosfolipaz kristalleridir (5). 1853 yılında Charcot, astımlıların havayollarında hücre dışı bipiramidal kristaller rapor etmiştir. 1872’de de Leyden tarafından yapılan bir gözlemlendi (6). CLK’ler, insan eozinofillerinde en bol bulunan proteinlerden biri olan galektin-10’dan (Gal10) oluşur. Son çalışmalar, Gal10’un aktive edilmiş eozinofillerin sitoplazmasından salındığını göstermektedir (7). CLK oluşumu hakkında belirsizlikler olsa da yüz elliden fazla hastalıkta tanımlanmıştır (8). Sıklıkla astım olmak üzere, alerjik reaksiyonlar, fungal ve helmintik enfeksiyonlar, nadiren hematolojik ve neoplastik hastalıklar gibi eozinofilik bozukluklarda da görülebilir (5).

Astım tanısında, prognozunun değerlendirilmesinde çeşitli laboratuvar parametreleri kullanılabilir. Havayolu enflamasyonunun bir belirteci olan balgam eozinofil yüzdesi ve eozinofilik yanıtla ilişkilendirilen CLK varlığı, astım hastalarında tedaviye yanıtın, hastalığın şiddetinin ve prognozun değerlendirilmesinde kullanılabilir (2-5).

Alt solunum yolu enfeksiyonlarına yol açan mikroorganizmalar çok virülan olabileceği gibi sağlıklı bireylerin orofarinkslerini kolonize eden ve patojenlikleri son derece düşük olan mikroorganizmalar da olabilir. Toplumdan edinilmiş enfeksiyonlarda izole edilen bakteriyel etkenler arasında Streptococcus pneumoniae, Heamophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, ve aerop gram negatif basiller sayılabilir. Hastane kökenli enfeksiyonlarda etkenler farklılık göstermektedir ve Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Enterobacter spp. gibi gram negatif basiller en sık etken olarak karşımıza çıkmaktadır (9-11). Astımın enfeksiyon ile alevlendiği bilinmekle birlikte, doğrudan etiyolojisi bakteriyel bir enfeksiyona bağlı değildir.

Bu çalışmada, Şubat-Haziran 2021 tarihleri arasında, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Cebeci Merkez Mikrobiyoloji Laboratuvarı’na rutin olarak gelen balgam örnekleri incelenmiştir. Astım tanısı olan ve olmayanlarda, balgamda bulunan eozinofil yüzdesinin saptanması, CLK varlığının araştırılması ve balgam örneklerinin kültür sonuçlarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

İzolatların Toplanması

Çalışmada Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Cebeci Merkez Mikrobiyoloji Laboratuvarı’na Şubat 2021-Haziran 2021 tarihleri arasında, balgam kültürü için gönderilen 74 adet balgam örneği [astım tanısı olan (n=22), astım olmayan (n=52) örnek] değerlendirildi. Hasta dosya kayıtları hastane bilgi sistemi incelenerek, hastaların astım tanıları  araştırıldı.

Gram ve Giemsa Boyaları ile Değerlendirimi

Gönderilen örneklerin eş zamanlı olarak Gram (PREVI® Color Gram, bioMérieux, Fransa) ve Giemsa boyalı preperatları hazırlandı. Gram boyalı preperatlar yassı epitel hücresi, polimorfonükleer lökosit ve mikroorganizma varlığı açısından değerlendirildi. Giemsa boyalı preparatlarda CLK varlığı ve eozinofil yüzdesi açısından incelendi.

Balgam kültürü için gönderilen örneklerin, kanlı agar (Becton Dickinson, ABD), MacConkey agar (Becton Dickinson, ABD) ve çikolata agara ekimi yapıldı, çikolata agar 24 saat 37 °C’de CO₂’li ortamda, diğer besiyerleri 24-48 saat 37 °C’de normal atmosfer koşullarında inkübe edildi.

Bakterilerin Tanımlanması

Gram boyama sonucuna göre “uygun örnek” olarak kabul edilen balgam örneklerinde üreyen mikroorganizmalar konvansiyonel yöntemler ve otomatize sistemler ile tanımlandı. Otomatize sistemler olarak VITEK II (bioMérieux, Fransa) ve MALDI-TOF MS (bioMérieux, France) kullanıldı.

Antimikrobiyal Duyarlılık Testlerinin Yapılması

İzolatların antimikrobiyal duyarlılık testlerinin (ADT) uygulanması ve değerlendirilmesi European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing önerileri doğrultusunda yapılmıştır. ADT uygulanmasında Kirby-Bauer disk difüzyon testi kullanılmıştır. Kolistin duyarlılığı sıvı mikrodilüsyon testi ile belirlenmiştir (12). Kalite kontrol suşları olarak E. coli ATCC 25922 ve S. aureus ATCC 25923 kullanılmıştır.

İstatistiksel Analiz

Tanımlayıcı istatistikler; kategorik değişkenler için frekans (%), sürekli değişkenler için ortalama ± standart sapma ve ortanca (minimum-maksimum) olarak verildi. Eozinofil yüzdesi ile astım olan ve olmayan grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık olup olmadığına bakılırken normal dağılım varsayımı sağlanmadığından Mann-Whitney U testi  kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edilmiştir. Verilerin değerlendirilmesi SPSS 11.5 for Windows programı kullanılarak yapıldı.

Çalışma için Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Araştırmalar ve Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır (karar no: İ02-59-23, tarih: 09.02.2023).

Bulgular

Toplam 74 balgam örneği değerlendirildi. Balgam örneklerinin tamamında ortalama eozinofil yüzdesi %1,34 olarak belirlendi. Astım tanısı almamış (n=52) hastaların ortalama eozinofil yüzdesi %0,63 olarak bulunurken, bu hastaların 25’inin (%35,1) balgam örneğinde hiç eozinofil görülmedi. Astım hastalarının (n=22) balgam örneklerinde ortalama eozinofil yüzdesi %3,04 olarak saptanmış olup, dört örnekte CLK tespit edildi ve bu dört örnekte ortalama eozinofil yüzdesi %3,25 olarak belirlendi (Tablo 1). Astımlı hastaların %40,9’unda balgamda eozinofili saptandı.

Kültürde üremeler değerlendirildiğinde; astım hastalarının 16’sında (%72,7), astımı olmayan hastaların 36’sının (%69,2) balgam örneğinde üst solunum yolu flora elemanları üredi. Astımı olan hastaların balgam örneklerinin 6’sında (%27,2) astımı olmayan hastaların 16’sında (%30,7) üreyen mikroorganizmalar etken olarak değerlendirildi (Tablo 2). Gram pozitif ve negatif bakterilerin antimikrobiyal direnç oranları Tablo 3 ve Tablo 4’te gösterildi. Çalışmamızda astımlı hastanın balgamından izole edilen S. aureus izolatında sefoksitin direnci saptanmıştır, metisilin dirençli S. aureus (MRSA) olarak kabul edilmiştir, astım hastası olmayanlardan izole edilen S. aureus izolatlarında sefoksitin direnci saptanmamıştır ve metisilin duyarlı S. aureus (MSSA) olarak kabul edilmiştir.

Tartışma

Astım, eozinofillerin önemli rol oynadığı, devam eden enflamatuvar süreç ile karakterize kronik bir havayolu hastalığıdır. Eozinofillerin değerlendirilmesi tanı ve tedavi takibinde önemlidir. Havayollarında eozinofillerinin artışının klinik ile uyumlu olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur (3). Farklı astım tiplerinde biyobelirteçlerin incelendiği bir çalışmada; 116 (%35) hastanın balgamında eozinofil oranını %3’ten fazla olduğu, balgamda eozinofil ortalamasının %0,8 (0,1-6,6) saptanmıştır (13). Bizim çalışmamızda balgamında eozinofili olan hastaların oranı %40,9, ortalama eozinofil sayısı ise astımlı olanlarda %3,04, tüm grupta %1,34 olarak bulunmuştur.

Bir çalışmada balgam eozinofil sayısı ve zorlu ekspiryumun birinci saniyesinde çıkarılan hava hacmindeki değişiklik ile tedaviye yanıt arasındaki ilişki değerlendirilmiştir. Çalışmada balgam eozinofil sayısının, astım hastalarında hastalık şiddetini, tedavi sonucunu ve prognozu değerlendirmek için yararlı bir belirteç olarak kullanılabileceği belirtilmiştir. Bizim çalışmamızda da havayolu hiperreaktivitesi olan ve olmayan balgam örneklerinde tespit edilen eozinofil yüzdeleri arasında fark istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0,05) (14).

CLK’lerin astım gibi hastalıklarda ortaya çıktıklarına dair çok sayıda rapor olmasına rağmen, enflamatuvar potansiyelleri tam olarak bilinmemektedir. Bir çalışmada; CLK’lerin proenflamatuvar sitokin IL-1β’nın salınımını indüklediği gösterilmiştir (15). CLK’lerin sadece eozinofilik enflamasyon belirteçlerinden daha fazlası olduğunu gösteren çalışmalar da mevcuttur (7). Hem astımı hem de bronkopulmoner enfeksiyonu olan bazı hastalarda Gal10 düzeyi yükselmiştir, bu da CLK’lerin eozinofillerle ilgili astımın bir belirteci olarak kullanılabileceğini göstermektedir (6). Bizim çalışmamızda CLK’lerin varlığı 22 astım hastasından sadece dördünde görülmüştür, bu hastaların ortalama eozinofil yüzdesi %3,04 olarak bulunmuştur ve CLK yokluğunun astım hastalığı için dışlayıcı bir kriter olmadığı yorumlanmıştır.

Astım alevlenmelerinde enfeksiyonlar daha sık karşımıza çıkmakla birlikte, bakteriyel enfeksiyonlar, mukosiliyer klirensi bozabilir ve akciğerde mukus üretimini artırabilir ve kronik alt solunum yolu enflamasyonuna neden olabilir. Bakteriyel enfeksiyonları akut astım alevlenmeleriyle ilişkilendiren kanıtlar sınırlı olmakla birlikte, solunum virüsleri insan alveolar makrofajlarının antibakteriyel savunmasını bozabilir ve böylece bakteriyel enfeksiyonların ortaya çıkmasını veya mikrobiyomda değişimi kolaylaştırabilir (16,17). Bizim çalışmamızda astımlı hastaların %18,2’sinde üreme saptanmıştır.

Solunum yolu örneklerinden izole edilen bakteriler ve direnç oranlarının bildirildiği çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Bir çalışmada 245 balgam kültürü değerlendirilmiştir, en sık üreyen ilk üç bakteri A. baumannii (%28,1), Klebsiella spp. (%24,5), P. aeruginosa’dır (%23,5) (18). Kronik obstrüktif akciğer hastalığında bakteriyel kolonizasyon ve akut alevlenme sıklığının ilişkisinin araştırıldığı bir çalışmada en sık izole edilen bakteriler S. pneumoniae, P. aeruginosa ve H. influenzae olarak belirtilmiştir (19). Bizim çalışmamızda benzer olarak izole edilen ilk üç bakteri P. aeruginosa, H. influenzae ve S. pneumoniae ve S. aureus’tur.

Ülkemizdeki 2016 yılı ulusal antimikrobiyal direnç sürveyans sistemi (UAMDSS) verilerine göre, invaziv Acinetobacter spp. izolatlarında çoklu ilaç direnci %83,5 olarak hesaplanmış ve kolistin direnci ise %6,7 olarak saptanmıştır (20). Çalışmamızda bir tane olan A. baumannii izolatı ise kolistin haricinde tüm antimikrobiyallere dirençli olarak saptanmıştır.

UAMDSS 2016 yılı verilerine göre, invaziv P. aeruginosa izolatlarında; çoklu ilaç dirençli izolatların oranı %32,6 olup, bu izolatlardaki kolistin direnci %5,2’dir. Seftazidim direnci %23,5, sefepim direnci %30,5 olarak belirtilmiştir (20). Bizim çalışmamızda ise çoklu ilaç dirençli izolat bulunmamakla birlikte, kolistin dirençli izolat elde edilmemiştir, izolatlarda sadece seftazidim (%37,5) ve sefepim (%37,5) direnci saptanmıştır.

Çalışmamızdaki H. influenzae’nın en dirençli olduğu antibiyotik trimetoprim sulfometoksazol olarak saptanmıştır. Altay Koçak ve ark. (18) çalışmalarında H. influenzae izolatlarının en dirençli olduğu antibiyotiğin trimetprim sulfometoksazol (direnç oranı %54,5) olduğunu belirtmiştir.

Avrupa Antibiyotik Direnç Sürveyans Sistemi verileri, S. pneumoniae izolatlarının %10,9’unun penisiline dirençli ve %21,1’inin eritromisine dirençli olduğunu göstermektedir (21). Ülkemizdeki 2016 yılı UAMDSS verilerine göre %13,8’i penisiline dirençli, %41,3’ü ise eritromisine dirençlidir (20). Çalışmamızdaki S. pneumoniae izolatlarının sayısı az olmakla birlikte %33,3’ü penisiline dirençli bulunurken, %66’sı eritromisin dirençlidir ve izolatların direnç oranı yüksektir.

Çalışmamızdaki üç S. aureus izolatından biri MRSA (%33,3) diğer ikisi MSSA’dır (%66,6). Ülkemizde UAMDSS 2016 verilerine göre MRSA oranı %23,6 olarak saptanmıştır. Altay Koçak ve ark. (18) çalışmalarında da MRSA oranını %28,6 olarak saptamıştır.

Çalışmanın Kısıtlılıkları

COVID-19 pandemisi nedeniyle kontrol grubuna oranla astım tanısı almış olan hastaların sayısının az olması çalışmamızın kısıtlılığıdır, sayının az olmasının örneklem büyüklüğü açısından negatif etkisinin olduğunu düşünmekteyiz.

Sonuç

Her ne kadar astım tanısı almış olan hastalara ait balgam örnek sayısı kontrol grubuna oranla daha az olsa da, eozinofil yüzdesi astım hastalarının balgam örneklerinde istatistiksel olarak daha yüksektir. Eozinofil yüksekliği CLK varlığı ile paralel artış göstermemekte olup, sadece CLK varlığı ile havayolu hiperreaktivitesinin değerlendirilmesinin tek başına yeterli olmayacağı, ancak hem eozinofil yüzdesi hem de CLK varlığının birlikte değerlendirilmesinin literatürle uyumlu olarak, astım gibi havayolu hiperreaktivitesi olan olgularda klinik tanıya yardımcı olacak laboratuvar parametreleri olarak kullanılabileceği kanaatine varılmıştır.

Etik

Etik Kurul Onayı: Çalışma için Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Araştırmalar ve Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır (karar no: İ02-59-23, tarih: 09.02.2023).

Hasta Onayı: Retrospektif çalışmadır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulunun dışından olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: D.Ö., E.O., E.E., Dizayn: D.Ö., E.O., E.E., Veri Toplama veya İşleme: K.A., H.A., A.A., B.N.A., M.E., İ.K., Analiz veya Yorumlama: D.Ö., E.O., E.E., İ.K., Literatür Arama: D.Ö., E.O., K.A., H.A., A.A., B.N.A., M.E., Yazan: D.Ö., E.O., E.E.

Çıkar Çatışması: Yazarlar arasında herhangi bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Finansal Destek: Çalışma için doğrudan veya dolaylı mali destek alınmadı. Çalışma ile ilgili herhangi bir firma veya kişi ile ilgili ticari bağlantı yoktur.