ÖZET

Kalp fonksiyonundaki değişimler ile gen ifadelerindeki değişimler arasında yakın ilişkiler olduğu ve özellikle gen ifadesi sonrası modifikasyonların bu değişimlerde başta rol aldığı bilinmektedir. Ancak kalpteki mikroRNA’ların (miRNA) yapısal değişimlerle ilişkisi henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu çalışmada yaşa bağlı seyreden yapısal değişimlerin miRNA gen ifade düzeyleriyle olan ilişkisinin araştırılması hedeflenmiştir.

Bu çalışmada Wistar türü erkek sıçanlar kullanılmıştır. Sıçanlar 3 aylık genç-yetişkin ve 12 aylık ileri-yaş-yetişkin olarak gruplandırılmıştır. Kalp doku kesitleri hematoksilin ve eozin ve masson trikrom boyama protokolü uygulanarak ışık mikroskobunda incelenmiştir. Kalp dokusu homojenatından miRNA izolasyonu hazır kitler kullanılarak yapılmış, ifade düzeyleri ise qt-PCR ile ölçülmüştür.

Histolojik bulgular kalbin sol ventrikül kısmında kalp kası liflerinde hipertrofi ve özellikle endomisyal alanda artan sayıda fibroblastlar ve bağ dokusu elemanlarının olduğunu göstermiştir. Öte yandan yaşlanmayla birlikte endomisyum kılıfı lif yoğunluğunda belirgin bir fibroz yapılanması gözlenmiştir. Biyokimyasal sonuçlar miRNA-1 miRNA-133a ve miRNA-133b gen ifade düzeylerinin azaldığını göstermektedir.

Çalışma sonuçları, sıçan kalp dokusunda yaşa paralel olarak miRNA gen ifade düzeylerindeki azalmanın yapısal ve fonksiyonel değişimlere aracılık ettiğini düşündürmektedir. Bu sonuçlar, yaşlanmanın etiyolojisini anlamak için miRNA’larla ilgili yeni tanı-tedavi hedeflerinin gerçekleştirilmesi açısından önemli olduğunu işaret etmektedir.

Giriş

Yaşlanma fizyolojik bir süreç olmasına karşın, kardiyovasküler yaşlanma günümüzde önemli bir sağlık sorunudur ve bireylerin ileri yaşlarında çeşitli kalp hastalıkları için en önemli risk faktörleri arasındadır. İlerleyen yaşla birlikte bireylerde organların dokularında ve damar sisteminde yaşa paralel olarak ilerleyen yapısal ve fonksiyonel değişiklikler kardiyovasküler hastalık gelişme riskini artırmaktadır. Bunlar arasında gözlenen en önemli patolojik durumlar sol ventrikül hipertrofisi prevalansının artması, diyastolik fonksiyon bozuklukları ve atriyal fibrillasyon insidansının artması olarak bildirilmiştir (1-3). Ayrıca, çeşitli klinik ve deneysel çalışma sonuçları, yaşlanmanın insülin direncinin gelişimi için göze çarpan önemli bir durum olduğunu, altında yatan birden fazla faktör bulunduğunu, bireylerde vücut ağırlığına ve yağ miktarına bağlı olmaksızın da insülin direncinin gelişebildiğini, normal insülin bağlanma süreçlerine rağmen insülin direncinin gelişmesinde postreseptör bozuklukların varlığını işaret etmektedir (4-6).

Kalp ve damar fizyolojisinde meydana gelen değişimler birbirini tetikleyen bir seri fizyopatolojik süreçleri beraberinde getirmektedir. Örneğin, yalnızca kalp dokusunda değil, aynı zamanda arterlerde sertliğin artması, kalpte yeniden modellenme mekanizmalarını devreye sokarak fibroblast proliferasyonunu ve sol ventrikül hipertrofisi gelişmesine neden olmaktadır. Sistem düzeyinde bu değişimler fibrotik doku artışı ve kalp çıktısının azalmasına yol açarak kardiyovasküler hastalıkların gelişimine zemin oluşturmaktadır (1,7). Klinik bulgular yanında deneysel çalışmalarda, özellikle hücre ölümleriyle beraber seyreden elektriksel iletim bozukluklarının atriyal fibrilasyona neden olduğu rapor edilmiştir (8). Bireylerde yaşa bağlı olarak sayıları ve yapısı değişen kardiyomiyositlerin, rejenerasyon yeteneği azalmakta, ve yerini kollajen üreten fibroblastlar alarak kalp dokusunda kollajen artışına neden olmaktadır. Bu değişiklikler, kalbin kontraktil fonksiyonunda değişiklik oluşturmamakla birlikte, gevşeme (relaksasyon) zamanında uzama ile sonuçlanmaktadır (9-11). Böylece, kalbin diyastolik fonksiyonu (gevşemesi, kompliyansı) bozulmakta ve diyastolik fonksiyon yetersizliği gelişmektedir.

Kalp fonksiyonundaki değişimlerin yaşlanmaya bağlı incelenmesinde, yaşa bağlı olarak kalpte gen-ifadelerinde değişimler olduğu yaklaşımı gen-ifadesi analiz yöntemlerinin (mikrodizinler gibi) gelişmesi ile hızla önem kazanmıştır (12-14). MikroRNA’lar (miRNA’lar) kısa, yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda, endojen regülatör RNA molekülleridir ve post-transkripsiyonel düzeyde spesifik miRNA’ları hedef alarak gen ekspresyonlarını baskılarlar ve bununla beraber tüm hücre tiplerinde bulunmalarına karşın bazı dokularda diğerlerine oranla daha fazla eksprese edilirler (15). Yapılan çalışmalarda miRNA’ların gelişim, metabolizma ve immün yanıt gibi birçok biyolojik süreci regüle etmektedir. miRNA’ların ekspresyonlarında değişiklikler birçok patoloji ile ilişkilidir. Bu sebepten ekspresyonlarının profillerinin çıkartılması kardiyovasküler patolojileri anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları için çok önemlidir (15,16). Günümüzde insanlarda, miRNA profilindeki bozukluğun birçok hastalığın gelişmesi ve ilerlemesinde etkili olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir ve kalp fonksiyonu ile ilgili olan çalışmalar halen devam etmektedir (9,17-20).

Kardiyomiyosit yaşlanmasının moleküler mekanizmasının incelendiği çalışmalarda, hücresel değişimlerin bazılarının çeşitli sinyal mekanizmaları ile ilişkili gen ifadesindeki değişimlerin rol oynadığı vurgulanmıştır (18). Bu hususta yapılan bir çalışmada, genç ve yaşlı sıçan serumunda 68 miRNA’nın farklı seviyelerde eksprese olduğu gösterilmiştir (21). Daha önce yapılan benzer çalışmalarda da miRNA’ların kardiyovasküler yaşlanmada ve yaşa bağlı kalp fonksiyon değişikliklerindeki rolleri incelenmiştir (9,17,22,23). Örneğin, daha önce insanlarda yapılan bir çalışmada; üç farklı kardiyak patolojiye (aortik stenozis, dilate kardiyomiyopati ve iskemik kardiyomiyopati) ait miRNA ekspresyonlarında farklılıklar olduğu gösterilmiştir (24). Ayrıca, miRNA profillerinin hipertrofi, kalp yetmezliği ve miyokardiyal enfarktüs gibi kardiyak patolojilerde değiştiği gösterilmiştir (19,20,25-27). Bu hususta yapılan her bir yeni çalışmanın miRNA’ların yaşa bağlı kalp fonksiyon değişikliklerinde önemli olacağı göz önüne alınarak, bu çalışmada kalp fonksiyonlarında yaşa bağlı önemli değişiklikler gözlenen genç-yetişkin (G-Y) ve ileri-yaş-yetişkin (İ-Y-Y) sıçan kalp dokusundaki yapısal ve gen-ifadesi değişikliklerinin birlikte incelenmesi hedeflenmiştir (28).

Gereç ve Yöntemler

Deney Hayvanları

Bu çalışmada kullanılan deney hayvanları Wistar türü erkek sıçanlar olup, hayvanlar Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Laboratuvarı’ndan temin edilmiştir. Ankara Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan izin alınmıştır (karar no: 2018-18-117). Sıçanlar 2 grup olarak planlanmış olup, genç yetişkin grup 3 aylık sıçanlardan (7 sıçan) ve ileri-yaş yetişkin grubu ise 12 aylık sıçanlardan (7 sıçan) seçilmiştir. Deney hayvanları, her kafeste 2-3 sıçan olmak üzere su ve yem kısıtlaması olmaksızın, standart deney hayvanları barınma koşullarında Biyofizik Anabilim Dalı’nda bulunan deney hayvanları barınma ve bakım ünitesinde deney anına kadar muhafaza edilmişlerdir.

Işık Mikroskobu İncelemesi

Sakrifikasyon işlemi sonrasında çıkarılan sol ventrikül %10 tamponlu nötral formalin solüsyonunda 72 saat tespit edildi. Çeşme suyunda yıkandıktan sonra sırasıyla %75, %96 ve %100 etanol serilerinden geçirilerek dehidrate edilen doku örnekleri ksilol ile şeffaflandırıldı. Dokular ışık geçirgen hale geldiklerinde parafin ile 56^oC etüvde 4 saat muamele edildi ve parafin bloklara gömüldü.

Elde edilen parafin bloklardan mikrotom aracılığıyla (Leica RM 2125 RT Bensheim, Germany) 5 m kalınlığında seri kesitler alındı. Kesitler hematoksilin eozin (HE) ve masson trikrom (MT) boyama protokolü uygulanarak boyandı. Boyanan kesitler ışık mikroskobu (Carl Zeiss AxioScope. A1 microscope, Oberkochen, Germany) ile incelendi ve fotoğraflandı. MT boyama protokolü uygulanan kesitlerde mavi renkli alanlar kollajen liflerin artış gösterdiği alanlar fibrozis alanları olarak değerlendirildi.

miRNA’ların Ölçümü

İzole edilen dokulardan toplam RNA izolasyonu için üretici firmanın protokolleri doğrultusunda RNA-izolasyon kiti kullanılmıştır (Ambion, mirVana miRNA Isolation Kit). Daha sonra, elde edilen toplam RNA’lar spektrofotometrede sayılmıştır (Nanodrop) ve 5 ile 70 μg arasındaki örnekler mikrodizin ve real time polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) deneylerinde kullanılmıştır. miRNA mikrodizin deneyi ve analizinde deney protokolü olarak üretici firmanın (Genisphere FlashTag Biotin RNA Labeling Kits for use with Affymetrix miRNA Arrays) deney protokolleri ve literatür bilgileri ışığı altında uygulanmıştır (29,30). Son aşamada elde edilen ham verilerin analizi için Integromics Biomarker Discovery ve GeneSifter (Affymetrix miRNA QC Tool) mikrodizin analiz yazılımı kullanılmıştır.

Gruplara ait cDNA’lardan 1-μL alınarak, kit içerisinde hazır olarak gelen, Syber Green I boyası, Universal Primer, polimeraz enzimi, miRNA spesifik primer ve su ile 20-μL olacak şekilde karıştırılarak real time PCR cihazına (Roche Light Cycler 1.2) yüklenmiştir. Floresan kayıtları reaksiyonun uzama aşamasında alınmıştır. Reaksiyonlarda Qiagen marka miRNA’lardan miR-1, miR-133a, ve miR-133b için spesifik primerler ve referans gen olarak da U6B primeri kullanılmıştır. Real time PCR deneyleri sonucu elde edilen ham data Δ/ΔCT metodu ile analiz edilmiştir (29,30).

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel olarak anlamlılıklar için ise t-test (p<0,05) uygulanmıştır. Tüm deney sonuçları ortalama ± standart hata ortalaması (SEM) olarak verilmiştir.

Bulgular

Deney Hayvanları ile İlgili Genel Bulgular

Bu çalışmada kullandığımız genç yetişkin (3 aylık) grubun ortalama vücut ağırlıkları olarak 240±08 g iken, ileri-yaş yetişkin (12 aylık) grubun ortalama vücut ağırlıkları 378±22 g olarak ölçülmüştür. Deney hayvanlarının yaşa göre normal sınırlar içinde kilo aldığı gözlenmiş olup, ileri-yaş grupta SEM değerlerinin daha büyük olduğu gözlenmiştir. Normal standart diyetle beslenen bu iki grup sıçanların açlık kan şekerleri ölçüldüğünde, bu gruplar için değerlerin sırasıyla 113±12 mg/dL ve 157±17 mg/dL ölçülmüştür. Gruplar arası farkın istatistiksel olarak anlamlı derecede olduğu (p<0,05) olduğu gözlenmiştir. Bu iki gruptaki sıçanlardan genç grubun kalp ağırlığı (ıslak) ortalama olarak 1,0±0,1 g iken ileri-yaş grubunda kalp ağırlığı 1,6±0,1 g ölçülmüştür. Yaşlanmaya bağlı olarak kalp ağırlığı ile vücut ağırlığı oranının (mg/g olarak) istatistiksel olarak anlamlı seviyede değişmediği (4,3±2,5 ve 4,3±1,4) dikkat çekicidir.

Histolojik Bulgular

Kalbin sol ventrikül kısmı ışık mikroskobu ile incelendiğinde bu grup hayvanlarda kalp fonksiyon bozukluğunun geliştiği elektrokardiyografi (EKG) ve mekanik aktiviteler ölçülerek daha önceki çalışmalarımızda gösterilmiş olduğu için bu çalışmada sol ventrikül dokularında ışık mikroskobu incelemeleri yapılmıştır (31-35). Işık mikroskobu incelemesinde HE boyalı kesitlerde G-Y grubuna ait sol ventrikül dokusu örnekleri olağan görünümde izlenmiştir (Şekil 1A). İ-Y-Y grubuna ait örneklerde kalp kası liflerinde hipertrofi ve özellikle endomisyal alanda artan sayıda fibroblastlar ve bağ dokusu elemanları dikkat çekmektedir (Şekil 1B). MT boyanmış G-Y grupta enine ve boyuna kesitler arasında fibroblastlar tarafından sentezlenen endomisyum kılıfı ince kollajen liflerden oluşmuş şekilde izlenirken (Şekil 2A), İ-Y-Y grupta kollajen lif yoğunluğunda belirgin artış fibrozis olarak değerlendirilmiştir (Şekil 2B).

Sol Ventikül Dokusunda Ölçülen miRNA Seviyeleri

Kaplten izole edilen sol ventrikül homojenatlarında ölçülen miRNA’lar daha önceki çalışmalarımız referans alınarak seçilmiştir (30). G-Y ve İ-Y-Y gruplarında sol ventrikül doku homojenetlarında quantitative-real-time PCR ölçümleri yapılmış olup, İ-Y-Y grubun verileri G-Y grubun verileri ile karşılaştırılarak veriler yüzde (%) değişim olarak sunulmuştur. Kalp fonksiyonu ile yakından ilişkili olduğu gösterilen miR-1, miR-133a ve miR-133b gibi miRNA’ların İ-Y-Y grubunda istatistiksel olarak önemli derecede (p<0,01) azaldığı gözlenmiştir (Şekil 3). Daha önceki çalışmalarımızda, 3 aylık ve 6 aylık normal sıçan grupları arası ile 6 aylık diyabetli ve normal sıçan grupları arasında kardiyomiyosit seviyesinde yapılan elektrofizyolojik incelemelerin farklı olduğunun gözlenmesi bu bulguları desteklemektedir (28,30).

Tartışma

Memelilerde yaşa paralel olarak kalbin yapısı, uyarılma-kasılma çiftlenimi (excitation-contraction coupling), hücre içi Ca²⁺ homeostazısı, kontraktil yapıların regülasyonu değiştiği gibi, organellerin ve diğer yapıların bütünlüğünün de bozulmasına kadar uzanan süreçlere aracılık eden fizyolojik süreçler mevcuttur. Yaşlanmayla birlikte sol ventrikül duvarının kalınlaşması, fibroz doku miktarındaki artış ve hücrelerin hipertrofiye uğraması gibi fizyolojik değişimler fonksiyonel olarak kasılma-gevşeme dinamiklerini etkilemektedir. Kalp fonksiyonundaki değişimlerin kalpte gen-ifadelerinde değişimler ile yakından ilişkili olduğu ve özellikle gen ifadesi sonrası modifikasyonların bu değişimlerde başta rol aldığı çeşitli çalışmalarda ileri sürülmüştür (12,14). miRNA’lar kısa, yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda, endojen regülatör RNA molekülleridir ve post-transkripsiyonel düzeyde spesifik miRNAlar’ı hedef alarak gen ifadesi düzeylerinin regülasyonunu sağlarlar (15). miRNA’ların regülasyon mekanizması gelişim, metabolizma ve immün yanıt gibi birçok biyolojik süreci kontrol etmektedir. miRNA’ların ekspresyonlarında değişiklikler birçok patoloji ile ilişkili olduğundan kardiyovasküler patolojileri anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için miRNA ifadelerinin profillerinin tayini son yıllarda giderek önem kazanmaktadır (15,16). Günümüzde klinik çalışmalar miRNA profilindeki bozukluğun hipertansiyon, ani kalp ölümleri, atriyal fibrilasyon, sol ventrikül hipertrofisi ve kalp yetmezliği gibi birçok hastalığın gelişmesi ve ilerlemesinde etkili olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (36-39).

Daha önceki çalışmamızda, yaşlanmada uyarı ileti sisteminin yavaşladığı ve QT-uzamasının dokularda ve hücrelerarası matrikste kollagen ve yağ birikiminden kaynaklandığı gösterilmiştir (40). Bu çalışmada histolojik bulgularımız kalbin sol ventrikül kısmında kalp kası liflerinde hipertrofi ve özellikle endomisyal alanda artan sayıda fibroblastlar ve bağ dokusu elemanlarının olduğunu göstermektedir. Öte yandan yaşlanmayla birlikte endomisyum kılıfı lif yoğunluğunda belirgin bir fibroz yapılanması gözlenmiştir. Bu bulgularımız önceki histolojik ve EKG bulgularımızla uyumludur (40).

Fibrozis oluşumu organ ve dokularda yapı-fonksiyon ilişkisini bozmaktadır. Enflamasyonun fibrozis süreçlerinde önemli rol aldığı özellikle sitokin, kemokin ve hücre büyüme faktörlerinin bu oluşumu tetiklediği bilinmektedir. Güncel çalışmalar miRNA’ların fibrozis oluşumuna aracılık eden birçok mekanizmayı regüle etmektedir (41). Özellikle miR-133 ailesinin kalp fibröz doku oluşumunu ve hipertrofik miyopatiyi baskıladığı gösterilmiştir (42). Bulgularımız miR-133a ve miR-133b ifade düzeylerinin azaldığını ve fibroz oluşumuna neden olduğunu göstermektedir. Ayrıca miR-133 ailesiyle birlikte bulunan ve fonksiyonlarını regüle eden miR-1 ifade seyivesinde anlamlı azalma görülmüştür. Bu azalmanın dilate kardiyomiyopatiye ve kalp yetmezliğine uzanan süreçlere aracılık etmektedir (43).

Sonuç

Yaşlanmaya paralel olarak miRNA gen ifade düzeylerindeki azalmanın yapısal ve fonksiyonel değişimlere aracılık ettiği göz önünde bulundurulduğunda, miRNA’larla ilgili yeni tanı ve tedavi hedeflerinin gerçekleştirilmesi yaşlanmanın etiyolojisini anlamak açısından oldukça önemli görünmektedir.

Etik

Etik Kurul Onayı: Ankara Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan izin alınmıştır (karar no: 2018-18-117).

Hasta Onayı: Bu çalışmada bir hayvan deneyi olduğundan, hasta onayı alınmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulunun dışından olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: B.T., Y.O., Dizayn: B.T., Y.O., Veri Toplama veya İşleme: Y.O., D.B., Analiz ve Yorumlama: Y.O., D.B., B.T., Literatür Arama: Y.O., D.B., Yazan: B.T.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Bu çalışmanın finansal desteği, TÜBİTAK SBAG-216S979 no’lu projeden sağlanmıştır.