ÖZET

Ovaryohisterektomi (OHE) ya da ovaryumun cerrahi operasyonlarında yapılan ligasyon doku bütünlüğü ve yapısını etkilemektedir. Özellikle çıkarılan ovaryumlar kemoterapi/radyoterapi alan hastalarda dondurulup çözülerek tekrar nakil edilecek ise ligasyonun ovaryum üzerindeki etkisinin histopatolojik analizi ve folikül görünüm ve yapılarının değerlendirilmesi önemli hale gelmektedir. Analizlerin doğru bir şekilde yapılabilmesi de dokunun doğru solüsyonla fikse edilmiş olmasını gerektirir. Biz de bu nedenle çalışmamızda kedi ovaryumlarında OHE sırasında uygulanan ligasyon sonrası dokunun uzaklaştırılması arasında geçen süre ile %10 tamponlu formalin ve Bouin fiksatiflerinin doku korunumu ve foliküller üzerine etkilerinin ortaya konulması ve elde edilen bulgular doğrultusunda uygun fiksatifin belirlenmesini amaçladık.

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Doğum ve Jinekoloji Kliniği’ne rutin OHE amacıyla gelen sahipli kedilerden ovaryumların alınması sırasında, tek taraflı ligasyon 3 dakika süreyle uygulandı. Her ovaryumun yarısı Bouin yarısı %10 tamponlu formalin solüsyonuna alınarak bir günlük fiksasyon süresinden sonra rutin takibe alınıp hematoksilen eozinle boyandı ve sağlam ve dejenere primordiyal foliküller sayılarak karşılaştırıldı.

Fiksatif tipinden bağımsız olarak operasyon sırasında ligasyon yapılarak ve yapılmaksızın çıkarılan ve doğrudan fiksatife alınan kedi ovaryumlarının hem makroskobik açıdan hem de histolojik değerlendirilmesinde doku korunumu ve bütünlüğü bakımından incelendiğinde bir fark ortaya çıkmadığı tespit edildi. Ovaryumlarda nekroz, konjesyon, ekstravazasyon izlenmedi. Fiksatiflerin doku korunumuna etkisi incelendiğinde; Bouin ile fikse edilen kedi ovaryum korteksinde gözlenen foliküller çoğunlukla normal görünümde iken formalin ile fikse edilenlerin çoğunluğu dejenere görünümde foliküllerden oluşmaktaydı.

Çalışmamızda kedi ovaryumlarının fiksasyonunda kısa süreli ligasyonun etkisinin bulunmadığı ve Bouin solüsyonunun formaline göre belirgin olarak daha iyi bir folikül ve hücresel bütünlükle birlikte tüm yapının korunumunu sağladığı ortaya konulmuştur.

Giriş

Uterus, tuba uterinalar ve ovaryumların çıkarılması [total abdominal histerektomi-bilateral salpingo-ooferektomi (TAH-BSO)], kadınların bening veya malign jinekolojik sorunları nedeniyle tıp uygulamalarında oldukça sık gerçekleştirilen cerrahi bir işlemdir (1). Veteriner hekimlik alanında da ovaryohisterektomi (OHE) çok sık uygulanan bir operasyondur; kedi ve köpeklerde olumsuz davranış değişikliklerinin sonlandırılması, yavru alınmak istenmemesi, uterus ve ovaryum patolojilerinin tedavisi, özellikle sokak köpeklerinde popülasyon artışının kontrol altına alınması ve sokak hayvanlarının refahının artırılabilmesi amacıyla rutin olarak uygulanmaktadır (2). Rutin cerrahi işlemler ya da acil müdahale gerektiren kanama durumlarında doku ve organların uygun şekilde ligasyonu kritik öneme sahip ve zorunlu bir prosedürdür. Kedi ve köpeklerde OHE’de her iki ovaryumun kraniyalinde, asıcı ligamentlerde ve uterusun kaudalinde yer alan arter ve venler dikkatle ligatüre edilmekte ve ardından ovaryumlar ile kornu uteriler uzaklaştırılmaktadır. Kanamanın önlenmesi amacıyla uygulanan bu ligatürler dokunun kan akımını önleyerek iskemiye yol açmakta ve dokuda anoksiye sebep olmaktadır (3). Ovaryum patolojilerinde ya da bilimsel araştırmalarda histopatolojik analizlere ihtiyaç duyulmaktadır ve ligasyonun doku korunması üzerin etkisi henüz yeterince ortaya konulmamıştır.

Histolojik ve histopatolojik incelemelerde fiksasyon, incelenecek dokunun mevcut haliyle kalması, otoliz ve kontaminasyon ve bozulmanın önlenmesi amacıyla gerçekleştirilen ilk ve en temel adımdır. Fiksasyon işlemi sırasında dokunun bozulmanın önlemek için kompleks bir seri kimyasal olay gerçekleşmekte, yarı sıvı haldeki hücreler yarı katı hale geçerek hücre ve hücre dışı yapıların mikroskopta incelenmesine olanak vermektedir. Tüm mikroskobik hazırlıklarda dokunun en uygun şekilde fiksasyonu zorunludur, aksi halde ortaya çıkan hatalar ilerleyen aşamalarda düzeltilemez ve doğru tanı yapılamaz (4). Doğru tanının konulabilmesinde dokuya uygun fiksatif seçimi de kritik öneme sahiptir. Bu amaçla formaldehit (%10 formalin), pikrik asit (Bouin solüsyonu), alkol (Klark solüsyonu) ve civa klorür içeren (Zenker solüsyonu) fiksatif türleri gibi solüsyonlar geliştirilerek uygun dokuya uygun fiksatif kullanımı sağlanmıştır (5). Günümüzde en sık kullanılan fiksatif türlerinden biri %10 tamponlu formalin solüsyonudur. Formalinin kararlı bir solüsyon olması, hazırlama kolaylığı, maliyetinin düşük olması, birçok boyama türüne uygun olması, çok az artefaktla hücre/doku yapısını koruyabilmesi ve donmuş kesitler için uygun olması gibi avantajları vardır. Ancak tüm bu avantajlarının yanı sıra yavaş fiksasyon özelliği, dokulara yavaş penetre olması, çekirdek fiksasyonunda yetersiz kalabilmesi ve büzülmeye sebep olması gibi dezavantajları da bulunmaktadır (4,6). Formaline benzer olarak Bouin solüsyonu da yaygın olarak kullanılan fiksatiflerdendir. Hücre çekirdeğinin ve glikojenin en iyi şekilde korunmasını sağlamakta, immünohistokimyasal uygulamalar için uygun bir fiksasyon oluşturmakta, küçük biyopsi örneklerinde dokuya verdiği sarı renk nedeniyle dokunun gömülmesi işlemi sırasında görünürlüğünü artırmakta ve kollajen fibrillerinin ölçümünde dokunun uygun şekilde fiksasyonunu sağlamaktadır. Bununla birlikte, dokuyu sarı renge boyaması, bazik boyalara az affinite göstermesi ve büzülmeye sebep olması gibi olumsuz yönleri de bulunmaktadır (4,7).

Sunulan çalışmada, kedi ovaryumlarında OHE sırasında uygulanan ligasyon ile dokunun uzaklaştırılması arasında geçen sürenin doku korunumuna etkisi ile kedi ovaryumunda %10 tamponlu formalin ve Bouin fiksatiflerinin etkisinin ortaya konulması ve uygun fiksatifin belirlenmesi amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

Çalışmanın materyalini kliniğimize rutin OHE amacıyla getirilen dişi kedilerin ovaryumları oluşturdu. Gebe olmayan 1-2 yaş aralığında evcil 6 kedinin ovaryumları, rutin OHE sırasında biri 3 dk süreyle ovaryan ve uterin pedikül ligasyonu yapılarak (L+) ve diğeri ligasyon yapılmaksızın (L-) alınarak Tablo 1’de içerikleri gösterilen %10 tamponlu formalin (pH: 7,2-7,4) ve Bouin solüsyonunda daldırma yöntemiyle tespit edildi.

Formalin (HistoPot, İrlanda) ve Bouin solüsyonunda (Pikrik asit; Merck, Almanya) 24 saat tespit edilen kedi ovaryumları rutin takip işlemine alındı. Dokudan fiksatif ve tortuların uzaklaştırılması için çeşme suyu altında yıkanması sonrasında dereceli alkollerden geçirilerek doku suyundan arındırıldı (dehidratasyon). Bu işlemden sonra ksilolde şeffaflandırıldı ve etüvde sıvı parafin içinde tutularak gömüldü. Mikrotomda (Leica, Germany) 4-6 µm kalınlığında alınan kesitler hematoksilen eozin ile boyandıktan sonra mikroskop altında incelenerek ovaryum folikülleri değerlendirildi. Sağlıklı ve dejenere olarak değerlendirilen primordiyal foliküller sayılarak karşılaştırıldı. Sağlıklı foliküller; çekirdek, sitoplazma ve hücre bütünlüğü olan ovositler ve çevresinde ovositle bağlantısı bozulmamış folikül hücreleri olarak değerlendirildi. Dejenere foliküllerde ise çekirdek ya da sitoplazma bütünlüğünü kaybetmiş ovositler ve çevresinde ovosit ile ilişkisini kaybetmiş ve hücre bütünlüğü bozulmuş folikül hücreleri olarak izlendi. Tüm folikül tipleri ovaryumda izlendi ancak primordiyal folikül sayısı istatistiksel değerlendirme için uygun bulundu.

İstatistiksel Analiz

Tüm istatistiksel analizler IBM SPSS Windows sürüm 14.0 (SPSS, Chicago, IL, ABD) kullanılarak yapıldı. Formalin ve Bouin grubunda sayılan normal ve dejenere primordiyal folikül sayıları arasındaki farklılık ki-kare testi kullanılarak analiz edildi. P-değeri <0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Bulgular

Fiksatif tipinden bağımsız olarak operasyon sırasında ligasyon yapılarak ve ligasyon yapılmaksızın çıkarılan ve doğrudan fiksatife alınan (immersiyon) kedi ovaryumları makroskobik açıdan değerlendirildiğinde görünümlerinde bir fark izlenmediği dikkati çekti. Ligasyon yapılan ve yapılmayan grupların histolojik değerlendirilmesinde doku korunumu ve bütünlüğü bakımından incelendiğinde bir fark ortaya çıkmadığı tespit edildi (Şekil 1).

Fiksatiflerin doku korunumuna etkisi incelendiğinde; Bouin ile fikse edilen kedi ovaryum korteksinde gözlenen foliküller çoğunlukla normal görünümde iken formalin ile fikse edilenlerin çoğunluğu dejenere görünümde foliküllerden oluşmaktaydı. Sağlıklı foliküllerin ovosit hücre zarı, sitoplazması ve çekirdeği yapısını korurken, folikül hücreleri ile olan bağlantıları ve teması bozulmamış şekilde gözlendi. İnterstisyumda hücrelerin bütünlükleri ve hücre dışı matriks yapılarıyla ilişkileri bozulmamıştı. Sağlıklı olmayan dejenere foliküllerin sitoplazması eozinofilik görünümde, piknotik  çekirdekli ovositler ve çevresinde düzensiz, ovositlerle bağlantıları yer yer kopuk ve bütünlüğünü kaybetmiş folikül hücreleri izlendi (Şekil 1).

Bouin fiksatifiyle tespit edilen ovaryumda değerlendirilen folikül sayısı 2.365, formalin ile fikse edilen ovaryumda değerlendirilen foliküllerin sayısı 2.345 olarak gözlendi. Bouin ile fikse edilen ovaryumdaki sağlıklı foliküllerin sayısının, formalin ile fikse edilen ovaryumdaki foliküllerin sayısına göre istatistiksel olarak anlamlı artış gösterdiği belirlendi (Tablo 2; c²(3): 3.460,57; p<0,001).

Tartışma

Cerrahi müdahalelerde ve araştırmalarda ligasyon oldukça sık yapılan bir işlemdir. Ligasyon yapılan doku ya da organda nekroz ve hemoraji ortaya çıkabilmektedir. Bu da tanı ve doku tanımlamasını değiştirip yanlış yorumlara neden olabilmektedir. Mogheiseh ve ark.’nın (8) çalışmalarında köpeklerde reprodüktif organlar uzaklaştırılmadan ovaryan pedikül ligasyonunun etkileri değerlendirildiğinde, ligasyondan sekiz hafta sonra histopatolojik muayene amacıyla alınan ovaryum örneklerinde iskemiye bağlı hemoraji, primordiyal ve primer foliküllerde nekroz, konjesyon, farklı derecelerde fibrozis varlığı ortaya konulmaktadır. Bu çalışmada ligasyondan sonra 3 dakika beklettiğimizde ligasyon yapılmayan gruba göre doku korunumu açısından bir fark olmadığını gösterdik. Mogheiseh ve ark.’nın (9) çalışması daha uzun süreli yapıldığı için hemoraji, fibrozis, konjesyon ve nekroz beklenen sonuçlardır. Kısa süreli ligasyonda uterin arterler ovaryumu destekleyerek hücrede/dokuda hasar oluşmasını önlerler (10). Kanser tedavileri öncesinde ovaryumların korunması amacıyla çıkarılıp dondurularak saklandığı ve tedavi sonrası transplante edildiği bilinmektedir. Bu nedenle, çalışmamızda kısa süreli ligasyonun doku bütünlüğü ve folikül korunumu açısından fark oluşturmadığı gösterilmiştir.

Fiksatiflerin dokuyu canlıdan çıkarıldığı haliyle koruması önemlidir. Fiksasyon, histolojik tekniklerin ilk ve en önemli basamaklarından birisidir. Deney yapılan gruplar arasında sağlıklı karşılaştırma yapılabilmesi dokuların yapılarının korunabilmesine bağlıdır. Bu hem dokunun nasıl çıkarıldığı hem de hangi solüsyonla tespit edildiğiyle ilgilidir. Hiçbir fiksatif ideal olmasa da, her fiksatif bir şekilde hücrenin/dokunun yapısını, protein içeriğini veya histokimyasal boyamasını etkiler ve bu nedenle fiksatif ve takip süreci, amaca göre dikkatlice en başta seçilmelidir (11). Bununla birlikte, formalin, histoloji laboratuvarlarının çoğunda tercih edilen fiksatif olmaya devam etmektedir. Ancak ne yazık ki, formalinin biyolojik bir tehlike olduğu doğrulanmıştır, fiksatif olarak rutin kullanımı büyük bir sağlık ve güvenlik sorunudur ve bu nedenle daha güvenli alternatifler arayışı sürmektedir (12). Bouin fiksatifi reprodüktif organlarda hücre/doku morfolojisini koruması ve immün işaretleme için gerekli epitopları muhafaza etmesi nedeniyle tercih edilen bir fiksatiftir (13). İçinde hem pikrik asit, hem formalin hem de glasiyal asetik asit barındırması nedeniyle hücrede asetik asitle ortaya çıkan şişme, pikrik asitle ortaya çıkan büzüşmeyle dengelenir. Formalinin sitoplazmada neden olduğu bazofili pikrik asitle düzelir. Pikrik asit hem koagülasyon gerçekleştirerek hem de çapraz bağlantılar yaparak fiksasyonu gerçekleştirir ve Bouin solüsyonunun esas fiksasyon mekanizması pikrik asitin etkisidir (14). Bufalo ve ark. (15) at ovaryumunu Bouin, Karnoy ve %10 formalin solüsyonunun her birinde farklı sürelerde (6, 12 ve 24 saat) tutarak fikse etmişler ve preantral folikülleri normal ve dejenere olarak değerlendirmişlerdir. Ovaryumların Bouin ve Karnoy solüsyonunda 12 ve 24 saatlerde fiksasyonu en uygun süre ve fiksatif olarak belirlemişlerdir. Sunulan çalışmamızda da kedi ovaryumunun Bouin solüsyonunda 24 saat tutulmasının uygunluğu bu çalışmanın bulgularına paralel olarak ortaya konulmuştur. Sarma ve ark. (16) fare ovaryumunda Bouin ve %10 formalin fiksatifi sonrasında primordiyal folikül sayımı yapıp karşılaştırdıklarında çalışmamızda olduğu gibi Bouin solüsyonunun folikül korunumunu sağlayarak tanımlanmasını kolaylaştırdığını bulmuşlardır.

Sonuç

Bir tek fiksatifin histopatolojik analizlerde tüm amaçlar doğrultusunda kullanılması mümkün değildir. Bazı fiksatifler çekirdek yapısını korurken, bazıları protein epitoplarının kaybını önleyerek immün işaretlemeyi kolaylaştırır, bir kısmı hücre iskeletinin bütünlüğünü sağlarken, diğerleri de organel düzeyinde korunum sağlayarak ince yapı incelemelerine olanak sağlar. Bu nedenle, her organ ve doku için doğru fiksatif denenerek ortaya konulmalı ve amaca göre en iyi sonuç veren fiksatif kullanılmalıdır. Sunulan çalışmada da kedi ovaryumlarının fiksasyonunda kısa süreli ligasyonunun etkisinin bulunmadığı ve Bouin solüsyonunun formaline göre daha iyi bir doku korunumu sağladığı ortaya konulmuştur.

Etik

Etik Kurul Onayı: Hayvanların bakımı, hayvanlara yaklaşım ve tüm deneyler Helsinki Deklarasyonu’na uygun olarak gerçekleştirildi. Kedi ovaryumları Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji kliniğine rutin ovaryohisterektomi nedeniyle gelen kedilerden alındı.

Hakem Değerlendirilmesi: Editörler kurulunun dışından olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Doku örneklerinin toplanması: F.T.Ç., D.B.A., M.A.D., S.S., Konsept: F.T.Ç., D.B.A., M.A.D., S.S., B.E., Dizayn: E.E., A.B., H.K., S.Ö, Veri toplama veya İşleme: F.T.Ç., D.B.A., M.A.D., S.S., B.E., Analiz veya Yorumlama: E.E., A.B., Literatür Tarama: F.T.Ç., D.B.A., M.A.D., S.S., Yazan: F.T.Ç., D.B.A., M.A.D., A.B., E.E.

Çıkar Çatışması: Yazarların çalışmayla ilgili finansal ya da başka bir konuda çıkar çatışması yoktur.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.