ÖZET

Sinir dokularının ince yapı düzeyinde incelenmesi nörobilimsel çalışmalar için gereklidir. Sinir dokusu hipoksi ve iskemiye hassastır. Bu nedenle, bu dokunun tespit ve takip edilmesi sinir dokusunun ince yapı düzeyinde değerlendirilmesi açısından kritiktir. Bulguların deneysel araştırmada kullanılan tespit solüsyonundan mı yoksa deneysel etkenden mi kaynaklandığını ayırt etmek zordur. Bu çalışmada, beş farklı tespit solüsyonunun merkezi sinir sistemi organları olan beyin ve medulla spinalis üzerine etkilerini, hücre ve organellerin ince yapı düzeyinde gösterilmesini ve karşılaştırılmasını amaçladık.

Çalışmamızda beş erkek Wistar albino sıçana (200-250 gr) anestezi uygulandı. Perfüzyon tespiti %4 paraformaldehit (PFA) ile gerçekleştirildi. Çıkarılan beyin ve medulla spinalis parçaları; (I) Trump’ın solüsyonu %4 PFA ve %1 glutaraldehit (GA), (II) %2 PFA ve %2,5 GA (2,5 mM CaCl içinde), (III) %2 PFA ve %2,5 GA, (IV) %2,5 G, (V) Trump’ın çözeltisi %4 PFA ve %1 GA (potasyum ferrosiyanat içeren %1 OsO4) olmak üzere beş farklı tespit solüsyonuna daldırıldı. Rutin takip işlemlerinden sonra, tüm ince doku kesitleri geçirimli elektron mikroskobu altında incelendi.

Grup 4’te beyin ve medulla spinaliste gözlemlenen hücre çekirdeği, perinükleer boşluk, mitokondri, granüllü endoplazma retikulumu, miyelin tabakası, endotel ve bazal laminasının diğer gruplara göre normal bir yapıda olduğu elektron mikroskobu altında izlendi.

Bu çalışmada, beyin ve medulla spinalisin elektron mikroskobu altında incelenmesi için tespit işleminde kakodilat tamponu ile hazırlanan %2,5 GA çözeltisinin uygun ve etkili olduğunu gösterdik.

Giriş

Dokuların ince yapı düzeyinde araştırmalarında elektron mikroskobu inceleme ve değerlendirilmeleri hala en ideal yöntem olma özelliğini korumaktadır (1). Tespit işlemi, mikroskobik incelemenin ilk ve en kritik basamağıdır (2,3). Elektron mikroskobik inceleme esnasında elde edilecek verilerin doğru ve güvenilir olabilmesi için dokuların doğru solüsyonların içerisine alınıp uygun sürelerde tespit edilmesi gerekmektedir (4). Uygun olmayan bir şekilde tespit edilmiş dokuların takibi sonucu ortaya çıkan artefaktlarla (hatalı görüntüler) normal yapıları ayırmak mümkün olamamakta, doku incelemeleri sırasında yapılan ölçümler ve testler de yanlış değerlendirmelere neden olabilmektedir (5).

Günümüzde elektron mikroskobunda ince yapı düzeyinde yapılan incelemeler birçok klinikte ayırıcı tanıda oldukça önemli bir yere sahiptir (6). Bu amaçla kullanılacak dokuların, özellikle santral sinir sistemi (SSS) organlarından alınan doku örneklerinin, en kısa zamanda tespit solüsyonuna alınması gerekir (7). Bekletilen dokularda otoliz, hasar ya da mikroorganizma kontaminasyonu gerçekleşir. Dokunun tespit edilmeden geçirdiği süreyi en aza indiren perfüzyon yöntemi hücre/dokuları henüz kalp pompalama işlevini sürdürürken tespit solüsyonuyla buluşturan bir yöntemdir ve literatürde tespit solüsyonlarının etkinliğini daha da artırdığı gösterilmiştir (8). Bu nedenle tespit solüsyonunun perfüzyon yöntemiyle uygulanması tercih edilir. Biz de çalışmamızda perfüzyon yönteminin daldırma yöntemine üstünlüğü nedeniyle perfüzyon yöntemini uyguladık.

Kullanılan yetersiz tespit solüsyonları dokunun analiz sonuçlarını değiştirebilir. Doğru şekilde seçilen tespit solüsyonları dokuları da yaşamın durduğu andaki haliyle koruyarak dokunun geçirdiği takip süreçlerini doğrudan etkiler. Glutaraldehit (GA) ve paraformaldehit (PFA), Trump solüsyonu ve Karnovsky’nin solüsyonu farklı laboratuvarlarda elektron mikroskobu incelemelerinde sıklıkla kullanılan tespit solüsyonlarıdır (3,9-11). Özellikle SSS dokularının hassasiyeti ve tespitinin zorluğu göz önüne alındığında; bu farklı tespit solüsyonlarının doku bütünlüğü ve hücresel yapıların korunması üzerine etkinliklerinin araştırılması ve karşılaştırılması zorunlu hale gelmektedir.

Farklı tespit solüsyonlarının kullanılması sonucunda doku incelemeleri üzerinden verilecek tanı, yapılacak gözlem ve ölçüm sonuçları değişkenlik gösterebilir, verilerimizi ve çıkarımlarımızı etkileyebilir. Bu çalışma; çeşitli tespit sıvılarının etkinliğini ve birbirine olan üstünlüğünü araştırarak, dokunun değişken laboratuvar yöntemlerinden etkilenmesini en aza indirmek ve kullanılan tespit yöntemlerini standardize etmek üzere planlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

Deney hayvanları ve deney tasarımı

Bu çalışma Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Deney Hayvanları Etik Kurulu tarafından onaylandı (no: 2020-20-162). Hayvanlar Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Deney Hayvanları Laboratuvarı’ndan temin edildi. Deneyler laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzuna göre gerçekleştirildi. Çalışmamızda Wistar Albino tipi 5 erkek sıçan (10-12 haftalık) kullanıldı. İntramüsküler 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin enjekte edilerek anesteziye alındı. Kalbin pompalama gücünden yararlanılarak, sol ventriküle takılan kateterle enjektöre basınç uygulanarak gönderilen heparinli serum fizyolojik, sağ atriumdan atılan kesiyle sıçanın dolaşım sistemini terk edene kadar beklendi. Kesiden gelen heparinli serum fizyolojiğin rengi şeffaflaştığında, yine sol ventriküle enjektör yardımıyla %4 PFA verildi. Tespit solüsyonunun hayvanın tüm vücuduna dağılması hayvanın burun ucu gibi periferik noktalarının pembeliğini kaybedip beyazlaşması ile anlaşıldı. Verilen tespit sıvısı henüz hayvan yaşarken kılcal damarlar aracılığıyla en periferik bölgelere kadar iletildiğinden dokuların ve hücrelerin hiç vakit kaybetmeden tespitleri başlamış oldu. Dokuların sertleşmesiyle bunun başarıldığı anlaşıldı. Tespitin ardından beyin ve medulla spinalisten 1 mm³’lük parçalar çıkarıldı. Her hayvandan alınan dokular, beş farklı solüsyonla 1. tespit yapılarak takip edildi. Deney grupları Tablo 1’de gösterilmiştir. Solüsyonlar taze hazırlandıktan sonra pH değerleri 7,2-7,4 olarak ayarlanıp +4 ºC de kullanılana kadar muhafaza edildi. Tekrar tespit solüsyonu pH’leri kontrol edilerek işlemler başlatıldı.

Geçirimli elektron mikroskobu (TEM) doku takibi

İlk üç grup ve beşinci grupta tespit solüsyonu fosfat tampon (PBS) içerisinde hazırlanırken, dördüncü grupta kakodilat tamponu kullanıldı. Tespit işlemi 4 °C de 4 saat süreyle gerçekleştirildi ve birinci tespit işleminden sonra dokular %1 osmiyum tetraoksit içerisinde 4 saat kadar oda ısısında bekletildi. Dereceli alkol solüsyonlarında dokuların suyu uzaklaştırıldıktan (dehidratasyon) sonra propilen oksite aktarılıp Araldit 6005’e gömüldü. Yarı ince kesitler 800 nm kalınlığında kesilip Toluidin mavisi-Azur II ile boyandı ve uygun alanlar belirlenerek ince kesitler 60-80 nm olarak ultramikrotomda (Leica Ultracut R) kesildi ve bakır gridlerin üzerine alındı. İnce kesitler uranil asetat ve kurşun sitratla boyandı ve ince doku düzeyinde değerlendirilmek üzere TEM’de incelendi (LEO 906E, Zeiss, Oberkochen, Germany).

Bulgular

Tüm hayvanlarda %4 PFA solüsyonuyla perfüzyonlu tespit işlemi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiş ve 5 hayvanın beyin ve medulla spinalisinden eşit büyüklükte parçalar alınarak 5 farklı tespit solüsyonuna konulmuştur. Ortak takip işlemi sonrası ince yapı incelemelerinin sonuçları TEM’de gözlenerek karşılaştırılmıştır.

Medulla spinalis ve beyinde hücre yapıları (nöron ve glia hücreleri), çekirdek, kromatin dağılımı, çekirdek zarı korunumu, organellerin korunması, miyelin ve damar yapılar incelenirken, özellikle damar yapılarında endotel hücrelerinin özellikleri ve bazal laminanın görünümü değerlendirildi (Tablo 2,3).

Grup 1: %4 PFA ve %1 GA (fosfat tamponu içerisinde) (Trump solüsyonu)

Medulla spinaliste hücre çekirdeklerinde kromatin dağılımı normal olarak izlendi, çekirdekçik belirgindi. Çekirdek çift zarı devamlılığı izlenirken iç ve dış zarının bazı alanlarda ayrıldığı gözlendi. Çekirdek zarının üzerinde bulunan çekirdek porlarının normal yapısı ayrıntılı olarak izlenebilmekteydi. Sitoplazmada mitokondriyon çift zar ve krista yapısı bozulmuş görünümdeydi. Miyelin yapıları ve akson içeriği düzenliydi. Nöropil alanında vakuol yapıları dikkat çekti. Medulla spinaliste yer alan damarların endotel hücreleri ince sitoplazmalarıyla hücre içeriği ve altlarında bulunan bazal laminayla ilişkileri normaldi, herhangi bir ayrılma izlenmedi (Şekil 1).

Beyinde hücre çekirdeklerinin zar bütünlüğünün ve çekirdek kromatin yapısının korunduğu yapısı ve hücre sitoplazmasında şişme (hidrops) dikkat çekti. Hücrelerin içinde organellerde ve nöropilde şişme ve vakuoller izlendi; hücre içi ve hücrelerarası alanda şişme görüldü. Beyinde bulunan kılcal damar endotel hücrelerinin sitoplazmasında şişmiş mitokondriyonlar gözlendi (Şekil 2).

Grup 2: %2 PFA ve %2,5 GA, (2,5 mM CaCl içeren fosfat tamponu içerisinde) (Karnovsky’nin fiksatifi)

Medulla spinaliste gözlenen hücrelerin kromatin dağılımı ve çekirdek zarlarının normal yapıda olduğu izlendi. Mitokondriyonların içerisinde kristaların kaybolduğu ve endoplazmik retikulum (ER) sarnıçlarının genişlediği dikkat çekti. Aksonların miyelinden ayrıldığı alanlar mevcuttu. Miyelin yapılar oldukça ayrık ve parçalanmış olarak gözlenirken kılcal damar endotel hücreleri ve perisitlerin normal yapıda olduğu gözlendi (Şekil 1).

Beyindeki hücrelerin çekirdek zarı, çekirdekçik ve çekirdek içeriği bütünlüğünü koruduğu çekirdek çift zarının düzenli ve birleşik olduğu gözlendi. Mitokondriyon zarı, kristaları ve granüllü ER sarnıçlarında genişleme yoktu ve zarlarda bütünlüğün bozulmadığı dikkat çekti. Damar yapılarının bütünlüğünü koruduğu, endotel hücrelerinde ve perisitlerde bütünlüğün korunduğu izlendi (Şekil 2).

Grup 3: %2 PFA ve %2,5 GA (fosfat tamponu içerisinde) (Karnovsky’nin fiksatifi)

Medulla spinaliste hücrelerin çekirdeğindeki ökromatin yapısı düzenli olarak izlendi. Çift tabakalı çekirdek zarı normal yapıdaydı, genişlemeler gözlenmedi. Miyelin yapıları bütünlüğünü korurken, yer yer ayrılmalar görüldü. Kılcal damar endotel hücreleri ve bazal laminaları normal yapıda izlendi. Endotel hücreleri içerisinde pinositik veziküllerin görünür ve sağlam yapıda olması dikkat çekmekteydi (Şekil 1).

Beyinde hücrelerin çekirdeklerinin bütünlüğünün korunduğu, çekirdek çift zarlarının ayrılmadığı izlendi. Mitokondriyon zar ve kristalarının, ER sarnıçlarının korunduğu dikkat çekti. Kılcal damar endotel hücreleri, perisit ve bazal lamina yapılarının normal olduğu gözlendi (Şekil 2).

Grup 4: %2,5 GA (kakodilat tamponu içerisinde)

Medulla spinaliste hücrelerde çekirdek zarının bütünlüğünü korurken hafif düzeyde genişlemeler gözlendi. Kromatin yapısının bütünlüğü korunmuştu. Sitoplazmasında bulunan mitokondriyonların zar yapılarının ve kristalarının yapısı korunmuş olarak izlendi. Miyelin yapılarının korunduğu ve düzenli olduğu izlendi. Kılcal damar endotel hücrelerinin sağlam olduğu, organel ayrıntılarının oldukça net gözlendiği dikkat çekti (Şekil 1).

Beyinde hücrelerin çekirdek yapısının ve bütünlüğünün korunduğu, çekirdek çift tabakasının düzenli bir şekilde gözlendiği, sitoplazma içeriği ve dağılımının normal olduğu dikkat çekti. Granüllü ER sarnıçları ve mitokondriyon zar yapılarının sağlam kaldığı gözlendi. Sitoplazmada organel yapılarının bütünlüğü bozulmamıştı, sitoplazma ya da nöropilde şişme izlenmedi. Kılcal damar endotel hücresinin çekirdek ve sitoplazmasının ve aynı zamanda bazal laminasının normal olduğu gözlendi (Şekil 2).

Grup 5: %4 PFA ve %1 GA (fosfat tamponu içerisinde) %1 OsO₄ içerisine potasyum ferrosiyanat eklendi (Trump solüsyonu)

Medulla spinaliste gözlenen hücrelerin çekirdeklerinde kromatin dağılımı normaldi ancak çekirdeğin çift tabakalı zarında yer yer genişlemeler izlendi. Mitokondriyonlarda şişme vardı. Miyelin yapılarında yer yer şişme ve ayrılma bölgeleri göze çarpmaktaydı. Akson içeriğinin normal olduğu, hücre içinde ve nöropilde boş vakuoller bulunduğu gözlendi. Damar endotel hücrelerinin normal morfolojide olduğu ve bazal laminalarının bütünlüklerini koruduğu dikkat çekti (Şekil 1).

Beyinde hücrelerin çekirdek bütünlüğünün korunduğu, çekirdek çift katlı tabakası ve sitoplazmadaki zarlı yapıların bozulmadığı izlendi. Mitokondriyon zar ve krista yapılarının korunduğu dikkat çekti. Hücreler arası bağlantılarının ayrılmadığı, devamlılıklarını koruduğu gözlendi. Kılcal damar endotel hücrelerinin ve bazal laminanın bütünlüğünü koruduğu izlendi (Şekil 2).

Tartışma

Geçmişe bakıldığında, son yıllarda tespit solüsyonlarındaki değişiklikler elektron mikroskobu hazırlama yöntemlerinde meydana gelen gelişmenin bir yansımasıdır. Farklı tespit solüsyonları, farklı takip süreciyle birleştirildiğinde, dokuların ince yapılarının korunmasında farklı sonuçlar ortaya çıkarır (12). Sinir sistemi, hücrelerinin oksijensizliğe dayanıksızlığı, bu hücrelerin hızla dejenere olması hatta ölümüne neden olur. Uygun ve hızla yapılan tespit bu hücrelerin korunmasını sağlayacaktır. Aynı zamanda beyaz cevherinde bulunan miyelin nedeniyle, yağ içeriği diğer organlardan farklıdır ve bu sebeple tespit işlemleri uzun sürmekte ve hızla yapılması gerekmektedir (13). Çalışmamızda SSS organlarından beyin ve medulla spinalisin perfüzyon yöntemiyle tespit edilmesinin ardından beş farklı tespit solüsyonunda tespit gerçekleştirildi ve elektron mikroskobunda ince yapı düzeyinde incelendi.

Tespitin hızla yapılmasının gerekliliğini göstermede; perfüzyon ve daldırma (immersiyon) yönteminin farklılığı Garman (14) tarafından yapılan çalışmada gösterilmiştir. Bu çalışmada sıçanlar üzerinde %10 tamponlu formalin ile perfüzyon ve daldırma yöntemleri uygulanıp hematoksilen eozinle boyanarak ışık mikroskobunda değerlendirilmiştir. Perfüzyon yöntemiyle beyinde normal yapıda nöronlar izlenirken daldırma yönteminde büzüşmüş, düzensiz görünümde bazofilik nöronlar (koyu nöronlar) ve nöron çevresinde çekilme sonucu boşluklar izlenmiştir (14). Lamberts ve ark. (15) perfüzyon ve daldırma yöntemiyle GA ve PFA solüsyonuyla, Palay ve ark. (16) ise osmiyum tetraoksit ile beyni tespit ettikten sonra sonuçları TEM’de karşılaştırdıklarında, perfüzyon yöntemiyle hücrelerin çekirdek, zarlı organel, sitoplazma ve hücre zarı düzeyinde daha iyi korunduğu sonucunu elde etmişlerdir. Biz de bu araştırmada, Garman (14), Lamberts ve ark (15) ve Palay ve ark.’nın (16) yaptığı çalışmalar ışığında, perfüzyon yöntemini kullanarak medulla spinalis ve beyinin farklı tespit sıvıları ve tamponlarla korunmasının karşılaştırılmasını çalışmacılara faydalı olacağı düşüncesiyle gözlemledik.

Tespit solüsyonları değerlendirildiğinde; GA, PFA’dan daha büyük bir molekül olduğu için dokuya girişinin yavaş olduğu, bu nedenle PFA’nın dokuya daha hızlı nüfuz ettiği bilinmektedir. Bu çalışmada, GA ile karşılaştırıldığında perfüzyon yönteminde daha hızlı tespit hızına sahip PFA seçilerek perfüzyonun etkisi en etkin seviyede kullanılmıştır (17). Çalışmamızda, perfüzyon yönteminin kullanılmasının bir sonucu olarak; kılcal damar yapılarının incelemelerinde endotel hücrelerinin tüm tespit solüsyonlarında ince yapı düzeyinde çok iyi korunduğu dikkat çekmiştir. Perfüzyon yöntemiyle tespit yapılması sırasında kılcal damar endotel hücrelerinin tespit solüsyonuyla ilk temas eden hücreler olması ve dolayısıyla tüm tespit solüsyonlarında normal yapıda gözlenmesi beklenen bir sonuç olarak değerlendirildi (18).

Tamponların farklılıklarına bakacak olursak; PBS, laboratuvar uygulamalarında yaygın olarak kullanılan, elektron mikroskobu solüsyonlarını seyreltmede tercih edilen bir tampon solüsyonudur (5). PBS tamponlama kapasitesi diğer tamponlara göre daha yüksek olduğu ve toksik olmadığı için öncelikli olarak kullanılmaktadır. Ancak bu çalışmada fizyolojik pH’de (pH=7,2-7,4) hazırlanan kakodilat solüsyonuyla %2,5 GA’nın diğer tespit solüsyonlarına göre sinir dokusunda hücreleri (nöron ve glia hücreleri), organellerini, damar yapıları (endotel, perisit) ve nöropili koruduğu ortaya konulmuştur. Kakodilat tamponu PBS’ye göre daha pahalı ve daha toksik olmasına rağmen yüksek reaktif gruplara sahip olmaması nedeniyle fosfat tampon gibi hücre elementleriyle reaksiyona girmez (19). Kakodilat tamponu içeriğinde toksik bir madde olan arseniğin olması nedeniyle çeker ocak altında dikkatli bir şekilde hazırlanmasına dikkat edilmelidir. Fosfat tampon içerisinde kalsiyum klorür (CaCl) kullanılması (Grup 2) hücrenin çekirdeğindeki DNA içeriğini sabitleştirir ve sağlamlaştırır (20). Tespit solüsyonunu tamponuna CaCl eklediğimizde çekirdekteki kromatin içeriğinin korunması nedeniyle çekirdek yapısının iyi korunduğu bizim gözlemlerimizde de ortaya çıkmıştır.

Bu çalışmada Trump solüsyonuyla (Grup 1 ve 5) tespit edilen medulla spinaliste hücrelerin içinde ve hücreler arasında vakuoller tespit edildi, beyinde ise hücrelerde (nöron ve endotel hücrelerinde) şişme gözlendi. Trump solüsyonunda GA oranının %1 oranında olması hücre ve hücre dışı yapıların korunmasının yetersiz olabileceğini düşündürdü. TEM ile sinir dokusunun ince yapı düzeyinde incelenmesinde ve hücre analizinde Trump solüsyonunun tercih edilirken bu sonuçların göz önünde bulundurulması önerilmektedir. Grup 1 ve 5 arasında ince yapı düzeyinde incelemelerde bir fark olmaması grup 5’te osmiyum tetraoksit içine konulan potasyum ferrosiyanatın tespit işleminde etkin rolü olmadığını göstermektedir. Wood ve Luft (21) yaptığı çalışmada karaciğer ve pankreasın tespitinde osmiyum tetraoksiti farklı (kollidin, fosfat, arsenat, sodyum bikarbonat, Veronal asetat ve potasyum kromat-dikromat) tampon solüsyonları içinde çözerek doku takibinde kullanmışlardır. Bu dokuların TEM’de incelenerek karşılaştırılmasında, tampon sistemleri arasında belirgin bir fark olmadığı bildirilmiştir (21).

Sonuç

Bu çalışma sonucunda  sinir dokularının elektron mikroskopta incelemesi için doku takibinde çok çeşitli tespit ve tampon solüsyonları kullanılırken tek iyi bir tespit solüsyonundan bahsetmek zor gibi görünmektedir. Tespit sonuçları arasında farklar olabileceği göz önünde bulundurulduğunda çalışmamızda kakodilat tamponuyla hazırlanan %2,5 GA solüsyonunun (Grup 4) hem beyin hem de medulla spinaliste hücrelerin (nöron ve glia hücreleri), organellerin, nöropilin ve kılcal damar ince yapısının korunmasında diğer gruplara göre sinir dokusu için elverişli ve etkin olduğunu gösterdik.

Etik

Etik Kurul Onayı: Çalışma Kasım-Aralık 2020 tarihlerinde yürütülmüş ve etik kurul onayı Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Yerel Etik Kurulu’ndan alınmıştır (onay no: 2020-20-162).

Hasta Onayı: Bu çalışma için hasta onamına gerek duyulmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulunun içinden ve dışından olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Hayvan Deneyleri: F.T.Ç., E.E., Konsept: F.T.Ç., E.E., Dizayn: E.E., Veri Toplama veya İşleme: F.T.Ç., E.E., Analiz veya Yorumlama: F.T.Ç., E.E., Literatür Arama: F.T.Ç., Yazan: F.T.Ç., E.E.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.