ÖZET

Tanı anında kayıt edilen platelet sayısındaki artış, gliablastoma ve diğer intrakraniyal patolojiler için bağımsız bir risk faktörüdür ve kötü prognoz göstergesidir. Tümör mikro-dolaşımı kaynaklı, birçok sitokin ve faktörlerin salınması sonucu plateletlerin aktive olması ve nöroenflamasyonda aktif rol oynaması bu hipotezin temelini oluşturur. Glial tümörlerde proliferasyon göstergesi olarak, Ki-67 indeksi ve mitotik aktivite sıklıkla kullanılmaktadır. Glial tümörlerde,yüksek Ki-67 indeks oranı ve mitotik aktivite agresif klinik progresyon,vasküler invazyon ve kötü prognoz ile karakterizedir. Ortalama platelet hacminin platelet sayımına oranı olan platelet volüm indeksini (PVİ), birçok intrakraniyal patolojilerde prognostik faktör olarak kullanılmasını öneren çalışmalarda artış mevcuttur. Bu çalışma da ilk defa PVİ, immün yanıt belirteci olarak, Ki-67 ve mitotik ativite ile karşılaştırdık. Böylelikle, hızlı hesaplanabilen ve de düşük maliyetli yeni bir prognostik faktörü ortaya koymayı amaçladık.

Girişimsel olmayan klinik çalışma için etik kurul onayı alındıktan sonra – son iki yıl içerinde dahil edilme kriterlerini sağlayan-gliablastom multiforme tanısı almış 65 hasta retrospektifolarak değerlendirildi. Rutin patolojik tanı süreçlerinden geçen hastaların Ki-67 indeksi ve mitoz sayısı Kayıt edildi. PVİ, ameliyat öncesi değerlendirme amacı ile yapılan tam kan sayımı testinden platelet sayısı ve hacmi kullanılarak hesaplandı. Çalışma retrospektif olduğu için hiçbir hastanın tedavi sürecini etkilemedi. PVİ; Ortalama platelet hacmi (fL) x100/Platelet sayısı (per 1000) olarak tanımlandı.

PVİ ile Ki-67 ve mitoz sayısı arasında; negatif yönde, zayıf derecede korelasyon bulundu.

Bu çalışma PVİ azalırken, Ki-67 ve mitoz sayısının arttığı ortaya konuldu. Yüksek gradlı glial tümörlerde PVİ, prognostik ve prediktif bir faktör olarak kullanılabilir. Fakat, yine de bu hipotezimizin, daha çok olgu sayısı ve tümör alt gruplarını da ortaya koyan çalışmalara ihtiyacı vardır.

Giriş

İntrakraniyal primer maligne tümörler köken aldığı stromal hücre mimarisine göre adlandırılıp sınıflandırılırlar.  Astrositlerden astrositomalar, oligodendrositlerden oligodendrogliomalar ve ependimal hücrelerden ise ependimomlar meydana gelir. Bunlar içinde en agresif olan ve en sık görüleni gliomalardır. Gliomalar, beynin primer maligne tümörlerinin yaklaşık %80’ini oluştururlar. Bu sistem histopatolojik görünümlerine göre derecelendirmektedir (derece=grad) (1-3). Tümoral dokudaki mitoz oranı derecelendirmenin başlıca belirleyicisidir. Mitoz oranının artması, büyüme potansiyelinin artmasına ve dolayısı ile kötü prognoza işaret eder (4). Mitoz oranını göstermede proliferatif indeks (Ki-67) proliferasyon indeksi sıklıkla kullanılmaktadır. Ki-67, tümör içerisindeki prolifere hücreleri gösteren antikordur. Ki-67 pozitif hücrelerinin oranı Ki-67 proliferasyon indeksini belirler. Literatürde, Ki-67 fraksiyonunun yüksek olduğu glial tümörlerin daha agresif seyrettiğine dair birçok çalışma mevcuttur (5,6). Diğer yandan, iskemik strok veya subaraknoid kanama gibi intrakraniyal patolojilerde platelet volüm indeksi (PVİ) ve prognoz ile ilgili yayınlarda artış görülmektedir. PVİ; ortalama platelet hacminin, platelet sayımına oranı olarak ifade edilir. Bu indeks, intrakranial patolojilere yanıt olarak ortaya çıkan nöroenflamasyon göstergesi olarak kullanılmıştır (7-9). Biz de çalışmamızda, tam kan sayımında rutin bulunan parametreler ile hesaplanan PVİ’nin glioblastoma için bir prognostik faktör olup olmadığını araştırdık. Bu amaçla çalışmamızda, glioblastomalarda iyi bilinen bir prognostik faktör olan mitotik aktivite, Ki-67 indeksi ve PVİ’yi karşılaştırdık.

Gereç ve Yöntem

Girişimsel olmayan klinik çalışma etik kurul onayı alındıktan sonra, Ocak 2016- Aralık 2018 tarihleri arasında gliablastoma nedeni ile tedavi gören hastalar listelendi (2018. 876). Bunların içinde hematolojik ve hepatik fonksiyonları yeterli olan hastalar değerlendirmeye alındı. (Hemoglobin>10g/dL, mutlak nötrofil sayısı>1500/mm³, platelet sayısı >100.000/mm³; total serum bilirubin < normalin 1,5 katı ve karaciğer fonksiyon değerleri < normalin 3 katı). Çalışmamızda, hematolojik ve hepatik fonksiyon yetersizliği, başka bir maligniteye sahip olunması, aktif enfeksiyon, kronik enfeksiyon veya herhangi bir immün yetmezlik sendromu (Edinsel bağışıklık yetmezliği sendromu, lösemi) bulunan hastalar ise değerlendirme dışına alındı. Çalışma, tedavi sürecini etkilemeden retrospektif dijital kart analizini içermektedir. Gliablastoma tanılı 65 hasta ile çalışıldı (Tablo 1). Nöro-görüntüleme ve fizik muayene ile ameliyat endikasyonu konulan tüm hastalardan başvuru anında yapılan tam kan sayımı kayıtları listelendi. Sonrasında tüm hastalar beyin cerrahi kliniğinde tedavi altına alındı. Elde edilen patoloji preperatları tek patolojist tarafından Hemotoksilen-Eozin ve immünohistokimyasal boyamalar ile değerlendirildi. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) sınıflamasına göre primer tanıları konularak derecelendirildi.

Histopatolojik Değerlendirme

Tüm histopatolojik örneklerin primer tanıları tek patoloji uzmanı eşliğinde değerlendirilerek raporlandı. Bu amaçla, hemotoksilen ve eosin boyama ile immünohistokimyasal boyamalar, Dako Autostainer Link 48 (Dako/Agilent Technologies, CA, USA) ve sekonder antikoru kromojen (Dako/Agilent Technologies, CA, USA) kullanılarak yapıldı. Analiz için dijital taramalar Leika Aperio AT2 otomatik slayt tarayıcı (Leica Biosystems Inc., IL, USA) (original magnification of digital slides 400x ) kullanılarak yapıldı. Ki-67 indeksi, streptoavidin-biotin ortamında primer antikorlar ile immünreaktivitesi ışık mikroskobu ile değerlendirilmiştir. Ki-67 için 100 tümör hücresi sayılmış (10’luk büyütme alanında) ve nükleer boyanma gösteren hücreler oranlanmıştır (Şekil 1). On büyük büyütmede, hiperkromatik farklı büyüklüklerde nükleuslar, pembe sitoplazma ve multiple fibriler uzantılar içeren mitotik figürlerde sayılarak not edildi. Ki-67 ile yoğun boyanan en az üç alan seçildi. Ki-67 pozitif hücrelerin sayısı toplam hücre sayısına oranlandı ve üç alanın ortalaması alındı. Değerlendirmede sadece tümör hücrelerindeki nükleer boyanmalar kabul edildi. Nekroz çevresi alanlar ve vasküler endotel boyanmaları değerlendirmeye alınmadı. Bunlar heterojen yapıya sahip glial tümörlerde sonuç standartizasyonu içindir. Bu işlemler rutin patolojik tanı için kullanılan süreçlerdir. Veriler ilgili kayıtlardan retrospektif elde edildi.

Platelet Sayısı ve Hacmi

Çalışmaya dahil edilen olguların ameliyat öncesi en son kan sayımı hesaplamalar için kullanıldı. Bu kan sayımlarının tamamı ameliyat öncesi değerlendirme amacı ile alınan örneklerden oluşmaktadır.

Platelet Volüm İndeksi Hesaplanması

PVİ, x100 olarak tanımlandı. Tek araştırmacı tarafından, hastaların Ki-67 değerleri ve klinik durumları bilinmeden hesaplandı.

İstatiksel Analiz

SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) yazılımının 24.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) versiyonu ile veriler analiz edildi. Normallik analizi için Kolmogorov-Smirnov testi kullanıldı. Non-parametrik tüm verilerin (Ki-67 indeksi, mitoz sayısı ve PVİ) Spearmans Correlation testi ile korelasyon analizleri yapıldı. P değeri <0,05 olarak anlamlı kabul edildi.

Bulgular

Son iki yıl içerisinde, histopatolojik incelemelerde gliablostom multiforme (WHO, Grade IV Glioma) tanısı konulan 65 hasta çalışmaya dahil edildi. Otuz kadın (%46,2), 35 erkek (%53,8) ve yaş ortalaması 57,82 [minimum=13, maksimum=78, standart deviasyon ±14,38] bulundu. Yerleşim yeri; 15 frontal lob, 24 temporal lob 9 pariyetal, üç basal ganglion, dört korpus kallosum, sekiz talamus, iki oksipital lob olarak tanımlandı. Kırk beş hastada eksizyonel, 20 hastada stereotaktik örnekleme yapıldı (Tablo 1). Platelet sayı ortalaması 245,800±73,94301 (min=125,000, maks=485.000), ortalama platelet hacmi 8,30015±1,847664 (min=5,520, maks=12,900), platelet hacim indeks ortalaması 3,64±1,22 (min=1,280, maks=7,04), Ki-67 indeksi ortalaması 36,62±13,11 (min=15, maks=70), on büyük büyütmede mitoz sayı ortalaması 13,65±11,04 (min=2, maks=45) bulunmuştur (Tablo 2).

Ki-67 indeksi ile mitoz sayısı arasında; pozitif yönde, orta derecede ve istatiksel olarak anlamlı bir korelasyon (bağıntı) bulundu (r_s=0,405, p=0,01). PVİ ile mitoz sayısı arasında; negatif yönde, zayıf derecede ve istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir korelasyon ortaya konuldu. (r_s=0,063, p= 0,619). PVİ ile Ki-67 indeksi arasında; negatif yönde, zayıf ve istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir ilişki bulundu (r_s=0,170, p=0,175).

Tartışma

İnsanın tümoral hastalıkları içinde maligne beyin tümörleri, yüksek ölüm oranına sahip ve sınırlı tedavi imkanları ile giden hastalık grubunu oluştururlar. Metastatik tümörler dışlandığında, yüksek dereceli glial tümörler bu grubun en sık ve agresif kısmını oluşturur. Dünya sağlık örgütünün sınıflama sistemine göre grad 4 glial tümörler glioblastoma multiforme (GBM) olarak adlandırılır. Ortalama görülme en sık 56-60 yaşlarında görülür (10). Bizim olgu grubumuzda da yaş ortalaması 57,82’dir. Erkek cinsiyette görülme sıklığı kadınlardan daha fazladır. Çalışmamızda da %53,8 ile erkek cinsiyet ağırlıktadır (11). GBM’ler hızlı çoğalma, anjiyogenez, mikrovasküler proliferasyon, beyin dokusuna invazyon ve nekroz ile karakterizedir. Glial tümörler histopatolojik olarak aynı olmasına karşın farklı proliferatif potansiyelleri olabilmektedir. Bu proliferatif potansiyeller için , mitotik indeks ve Ki-67 indeksi sıklıkla kullanılmaktadır. Mitototik indeks, hemotoksilen-eosin boyası ile mitotik figürlerin 10 büyütme alanında sayılabilen mitotik figür sayısının basitçe sayımına dayanır. Ki-67 tümör içerisindeki prolifere hücreleri gösterebilen bir antikordur. Ki-67 ise hücre siklusunun G1, S, G2 ve M fazlarında bulunan non-histon nükleer proteinde lokalize bir epitopudur. Parafin kesitlerde monoklonal antikorlar ile Ki-67 indeksi pratik bakılabilmektedir. Hücre proliferasyon siklusunu tanımlayan G1, S, G2 ve özellikle de M fazlarında, Ki-67 fraksiyonları ortaya çıkar. Eksprese olan bu proteinlerin antikor ile tayinleri, tümörün proliferasyonu, invazyon ve vaskülarizasyonu hakkında anlamlı bilgiler verir. Böylelikle glial tümörlerin proliferasyon potansiyelleri ortaya konulur (12-14). Çalışmamız da mitoz sayısı ve Ki-67 indeksi arasında olumlu, orta derecede korelasyon bulduk. Bu bulgumuz literatür ile uyumludur (4,5). Palizatlaşan hücre nekrozu GBM’nin patolojik karakteristik özelliklerinden birisidir. Bu nekroza hipoksinin katkısı olduğu gibi tümoral dokunun mikroçevresinin de katkısı vardır. Makrofajlar, eosinofiller, nötrofiller ve T lenfosit gibi immün hücrelerin infiltrasyonu ve bunların salgıladıkları sitokinler tümör mikroçevresine ve nekroza katkı sağlar. Tümoral dokuyu yabancı cisim ve doku hasarı olarak algılayan immün sistem aktive olarak immün mediatörler salgılar. Bu mediatörler proliferasyona, anjiogenezise, invazyona ve hatta tümör hücrelerinde genetik ve epigenetik değişikliklere sebep olur (15-17). Enflamasyon, daha doğru ifade ile nöro-enflamasyon tüm tümoral süreç boyunca aktif rol oynar. Trombositler, GBM’lerde nöro-enflamasyonun ana hücrelerinden biridir. Daha önceki çalışmalarda, tanı anındaki trombositozun bağımsız bir risk faktörü olduğu ve beklenen yaşam süresini kısalttığı ortaya konulmuştur. Tümoral dokunun trombo-poetik faktörler üretmesinin platalet sayı ve fonksiyonarındaki artışa anlamlı katkısı vardır. İnterlökin-6 (IL), megakaryositopoezis üzerinde stimüle edici etkili bir sitokindir. Yapımı IL-1 tarafından aktive edilir. Hem IL-1, hemde IL-6 gliablastoma hücreleri tarafından sekrete edilir. Granülosit koloni stimüle edici faktör ve granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktör benzer şekilde gliablastom hücrelerinden salınır. Bunlar otokrin olarak gliablastoma hücrelerini potansiyelize ettiği gibi trombopoezisi de destekler (18-20). Dolayısı ile trombosit sayısı ile tümoral hücre aktivitesi arasında bir korelasyon vardır. Fakat, megakaryositopoezisin de aktif olmasından dolayı dolaşımda plataletler tek formda bulunmazlar. Farklı hacim ve sayıda platalet alt grupları heterojen bir şekilde bulunur. Bu yüzden platelet ile ilgili trombo-nöro-enflamasyonu tahmin etmekte daha spesifik bir indeks olarak platalet volüm indeksi artan sıklıkta kullanılmaktadır.

Bizde çalışmamızda hem kolay ortaya konulabilen hem de maliyeti düşük PVİ’yi bir nöro-enflamasyon belirteci olarak mitoz sayısı ve Ki-67 indeksi ile ilişkisini araştırdık. PVİ ile mitoz sayısı ve Ki-67 arasında zayıf ve negatif yönde bir bağlantı bulduk. Yani mitoz sayısı veya Ki-67 arttıkça PVİ azalma eğilimindedir. Bu durum öne sürdüğümüz nöro-enflamasyonun potansiyalize edildiği hipotezimize uyumlu olmakla beraber istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0,619 ve p=0,175). Olgu sayısının sınırlı olması istatistiği etkilediğini düşünmekteyiz.

Bu çalışmada, yüksek gradlı glial tümörlerde PHİ’nin bir prognostik faktör olabilirliğini araştırdık. Mitoz sayısı ve Ki-67 uzun yıllardır prognoz belirlemede güvenilir belirteçler olarak kullanılmıştır. PVİ ise bu amaçla, literatürde ilk defa GBM’li hastalarda analiz edilmiştir.

Glial tümör hastalığının başlama zamanı belirsizdir. Alınan hematolojik incelemeler ameliyat öncesi alınan tetkiklerdir. Tüm olguların, tümör başlama zamanı farklı olabileceğinden nöro-enflamasyonun süresi de farklıdır. Heterojen bir grup oluşturmak oldukça zordur. Çalışma retrospektif ve sınırlı sayıda olgu ile yapıldığından GBM alt gruplarında inceleme yapılmaması diğer bir yetersizliğidir. Mitotik indeks ve Ki-67 günlük pratikte sıklıkla kullanılmasına rağmen, zayıf prognostik faktör olarak gösteren az sayıda çalışmalar mevcuttur. Diğer yandan çalışmamızda mitoz sayısı, Ki-67 ve PVİ arasında zayıf derecede korelasyon bulunmuştur. Mevcut kullanılan korelasyon analiz testleri verilerin uç değerlerinden ve olgu sayısından etkilenmektedir. Hem olgu sayısının az olması hem de GBM alt gruplarında farklı uç değerlerin görülmesi istatistik hesapları da etkilemektedir (21,22).

Sonuç

GBM’lerde genetik ve moleküler düzeyde birçok prognostik faktörlerin tanımlandığı günümüzde PVİ, maliyet olarak ucuz ve kolay hesaplanan bir yöntemdir. Homojen olarak oluşturulmuş ve subgrupları da içeren daha fazla örnekler ile güvenilirliğini arttıracak çalışmalara ihtiyaç vardır.

Teşekkür: Patolojik tanı ve verilerin elde edilmesinde, literatür taramasında büyük katkısı olan Bezmialem Vakıf Üniversitesi Patoloji Anabilim Dalı’ndan Uzm. Dr. Ganime Çoban’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışma, Bezmialem Vakıf Üniversitesi Klinik Olmayan Etik Kurul tarafından onaylanmıştır (2018.876).

Hasta Onayı: Retrospektif veri analiz çalışmasıdır. Hiçbir hastanın tanı ve tedavi sürecinde bir değişiklik yapmamıştır. Hasta onamları alınmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Finansal Destek: Yazar finansal destek almadığını beyan eder.